假结核耶尔森氏菌三型分泌系统转录调控网络研究

耶尔森氏菌是研究病原细菌三型分泌系统（T3SS）的经典模式细菌，其T3SS相关蛋白由70Kb左右的质粒编码，是一个相对独立的毒力系统。该系统受到非常精细的调控，但其转录调控过程还有很多问题目前并不清楚。如该系统中哪些蛋白是转录调控蛋白？它们的作用靶标有哪些？各个基因如何协调表达等等。系统的转录调控网络研究将为解答这些问题提供重要的线索。本项目以假结核耶尔森氏菌为研究对象，在建立一套高效的双质粒系统的基础上，系统分析鉴定编码T3SS的pYV质粒上所有的转录调控基因及其调控靶标，确定T3SS内部所有的转录调控作用，建立T3SS内部完整的转录调控网络，并挑选关键的调控作用进一步通过构建突变体和体外蛋白-DNA相互作用等方法进行验证。项目的实施将首次展示T3SS内部完整的转录调控网络图，系统阐释耶尔森氏菌T3SS诱导表达的整个转录调控细节，为更深入研究T3SS这套生物机器的运转机制奠定基础。

病原细菌三型分泌系统（T3SS）受到复杂而精细的调控，但其调控过程还有很多问题尚不清楚。本项目以假结核耶尔森氏菌为研究对象，系统分析鉴定了编码T3SS的pYV质粒所有转录调控基因及其调控靶标，确定了T3SS所有的转录调控单元，建立了T3SS内部完整的转录调控网络，并从不同角度对调控机制开展了深入研究。项目取得了以下重要进展： .1. 建立了一种零背景定向克隆新方法，整个克隆过程只需PCR扩增目的片段，直接与载体连接转化宿主菌，通过抗性筛选得到100%阳性克隆，大大提高了克隆效率。.2. 在系统分析pYV毒力质粒所有基因启动子活性的基础上，研究了毒力质粒在转录水平应对温度和钙离子两个环境因素的应答反应过程。选择T3SS最重要的转录调控蛋白LcrF为研究对象，系统鉴定了LcrF的调控靶标。通过改变T3SS重要的负调控蛋白LcrQ和LcrF的表达水平，发现当LcrQ蛋白表达量高于LcrF时，会表现出对T3SS的负调控效应，说明胞内LcrQ与LcrF表达水平的平衡对T3SS的调控起重要作用。.3. 构建了pYV毒力质粒的基因过表达文库，筛选调控T3SS表达的基因，发现T3SS装置蛋白编码基因yscV在其中起重要作用。深入的调控机理研究表明YscV通过控制LcrQ的分泌调控T3SS，据此提出了依赖于YscV的LcrQ分泌介导的反馈抑制模型。.4. 筛选到Rcs双组分系统的应激调控蛋白RcsB在pYV毒力质粒上的靶标基因，确证RcsB特异性直接结合这些靶标基因的启动子区域，促进这些基因的转录，这种转录激活作用依赖于RcsB的磷酸化状态。该结果首次证明Rcs系统可以调控T3SS，并且首次发现 RcsB可以通过LcrF的转录激活作用全局性调控T3SS。 . 项目分别从转录调控网络、反馈调控机制以及外界环境信号感应等方面系统研究了T3SS调控机理，为进一步系统阐释T3SS的调控机制提供了重要基础和新的思路。项目超额完成预定目标，共发表标注该基金资助的SCI论文6篇，包括微生物学领域主流刊物Mol. Microbiol和Environ. Mircobiol；应邀在本领域国际会议作报告1次, 并受邀撰写该领域进展综述；获得发明专利1项。