两种镇痛活性肽的结构解析、可溶性表达及对靶细胞离子浓度的影响

通过分析两种镇痛活性肽N-末端以及分子内部分氨基酸序列，利用简并探针、引物等，从cDNA文库、cDNA pool 克隆活性肽cDNA，测序获得其碱基序列。利用特定引物，以染色体DNA为模板，PCR扩增活性肽基因。通过生物质谱测定天然活性肽分子量，结合上述研究所获得的cDNA、基因序列以及部分氨基酸序列，相互比对验证，获得两种镇痛活性肽一级结构信息。利用基因工程技术，使两种镇痛活性肽分别在大肠杆菌中实现非融合可溶性表达。分离纯化制备的基因工程表达活性肽，在实验动物模型的镇痛生物活性，应与天然活性肽的基本一致，利用膜片钳全细胞记录模式和激光扫描共聚焦显微镜技术，研究确定活性肽对神经细胞内离子浓度的影响。镇痛活性肽的结构解析、基因工程表达、初步作用机制研究，为从离子通道角度进一步研究镇痛机制以及其药靶等，提供一个崭新的材料与思路，也为拥有原创性自主知识产权新药的研发及产业化，奠定坚实的物质基础。

通过三种方法（两种cDNA，一种染色体DNA）所获得的两种镇痛活性肽cDNA和基因序列以及其编码的氨基酸序列的比对、相互验证，再利用每种天然镇痛活性肽N-末端和分子内部分氨基酸序列与相应的基因编码氨基酸序列、质谱实测的分子量与理论分子量（由基因编码的成熟肽推导分子量）的进一步比对验证，最终准确解析两种蝎镇痛活性肽的一级结构信息及其基因序列。两个活性肽成熟肽结构如下：.BmKAGP-SYPU1：GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHCWCINLPDDKPIRIPGKCHRR.BmKAGP-SYPU2：VKDGYIADDRNCPYFCGRNAYCDGECKKNRESGYCQWASKYGNACWCYKLPDDARIMKPGRCNGG.通过高保真Taq DNA聚合酶，分别PCR扩增两种活性肽基因，并将其重组至课题组已构建的大肠杆菌非融合可溶性表达质粒pSYPU-1。转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃培养并由IPTG诱导其在胞内表达，SDS-PAGE检测结果显示活性肽实现可溶性表达，BmKAGP-SYPU1表达量占菌体总蛋白的12%以上，BmKAGP-SYPU2表达量占菌体总蛋白的30%以上。经IPTG诱导表达的大肠杆菌，离心收集菌体并超声破碎，离心上清液经镍离子螯合亲和层析柱吸附以及阶段洗脱纯化，再利用常规的离子交换层析纯化至电泳纯，HPLC检测纯度在95%以上。.以小鼠醋酸扭体为实验模型，表达产物的生物活性与天然活性肽的相当。在剂量为1mg/kg时，重组BmKAGP-SYPU1对由醋酸引起的小鼠扭体反应抑制率为68.8% (p<0.01)，天然BmKAGP-SYPU1抑制率为69.8%(p<0.01)，阳性对照药吗啡在剂量为1.0mg/kg小鼠体重时对小鼠扭体反应抑制率为65.2% (p<0.01)，且C端精氨酸残基与活性肽镇痛活性密切相关。在剂量为0.1mg/kg时，重组BmKAGP-SYPU2对由醋酸引起的小鼠扭体反应抑制率为61.2% (p<0.01)，天然BmKAGP-SYPU2抑制率为64.3%(p<0.01)，阳性对照药吗啡在剂量为1.0mg/kg小鼠体重时对小鼠扭体反应抑制率为65.2% (p<0.01)。.活性肽及其制备方法申请国家发明专利两项，发表SCI收录论文三篇。