基于肠上皮细胞外泌体调控巨噬细胞极化的机理研究

Macrophage polarization play an important role in maintaining the animal intestinal immune homeostasis. Accumulating evidence suggests probiotics can alter the macrophage phenotypes and functions to control the intestinal inflammatory response and achieve better effects on the prevention and treatment of intestinal dieases, but its potential regulatory mechanism is still not clear. Based on the previous study, We choose the probiotics (Bacillus amyloliquefaciens BaSC06) and induce the porcine intestinal epithelial cells to release the exclusive exosomes (BaSC06-IEC-exosome), then we isolated them by using ultra high speed centrifugation and their characters were determined by transmission electron microscopy and WB. To clarify the novel mechanism of the BaSC06-IEC-exosome regulate the Mφ polarization with probiotics treatment, we will detect the types of macrophage polarization and designed phagocytosis experiment to verify the macrophage polarization. Moreover, we will further explore its potential regulatory mechanism between BaSC06-IEC-exosome and Mφ polarization via analyzing the differences in the internal composition between BaSC06-IEC-exosome and IEC-exosome. This will provide a new perspective on study the relationship between probiotics and intestinal immunity.

巨噬细胞极化对维持动物机体的肠道健康和免疫平衡具有十分重要的意义。近年来研究发现益生菌可通过影响巨噬细胞表型和功能的变化进而缓解肠道炎症反应，并起到较好的防治作用，然而其具体的调控作用机制仍不明确。本项目拟在前期研究的基础上，使用解淀粉芽孢杆菌BaSC06刺激猪肠上皮细胞诱导分泌特异性的外泌体BaSC06-IEC-exosome，结合透射电镜和WB技术鉴定BaSC06-IEC-exosome的特征，并摸索优化BaSC06-IEC-exosome分离的最佳条件；研究在益生菌作用条件下，BaSC06-IEC-exosome对Mφ极化特有的调控作用。此外，深入分析比较外泌体之间的内部成分差异，并进一步探索其潜在的调控机制。这将为人们提供一个新的视角来解读益生菌与肠道免疫之间的关系。同时为益生菌调节巨噬细胞极化机理的阐明提供新的理论依据，并为其在养猪业中的科学应用提供指导。

益生菌可以调节宿主肠道免疫，以维持或改善机体健康。巨噬细胞作为免疫系统的哨兵，它的成熟与极化维系着机体肠道健康和免疫平衡。近年来越来越多的研究发现益生菌可通过调节巨噬细胞表型和功能的变化来提高机体免疫力，进而缓解肠道炎症反应，最终起到较好的疾病防治效果，然而益生菌调控巨噬细胞的作用机制仍不清楚。本项目使用本实验室分离的解淀粉芽孢杆菌BaSC06诱导肠道上皮细胞分泌获得的特异性外泌体，并研究了其对巨噬细胞成熟和极化的调控影响。在有无BaSC06的刺激作用下，我们从肠道上皮细胞中分离出了两种外泌体，分别命名为Ba-Exo和Exo。检测发现它们的直径大小处于40-100nm范围，具有典型杯状或圆形囊泡外形。它们的表面呈现出典型的外泌体相关蛋白CD9和TSG101等。外泌体Ba-Exo和Exo不仅可以有效穿透细胞膜，同时还能促进细胞的迁移，其中Ba-Exo效果更为明显。Ba-Exo和Exo可以抑制巨噬细胞的吞噬作用，在一定程度上促进了巨噬细胞的成熟。此外，Ba-Exo在3D4/2细胞中能显着增加iNOS的表达，降低Arg-1的表达，表明Ba-Exo可以促进M1型巨噬细胞极化。为了探索Ba-Exo和Exo在巨噬细胞成熟和极化调控方面的差异，我们对外泌体中的小RNA进行了高通量测序，分析发现Ba-Exo组内部miRNA相比较于Exo组具有明显差异表达的共计375个，其中上调表达的有112个，下调表达的有263个。从中我们对极化相关miRNA进行体外检测验证。在这些miRNA中，我们发现与Exo组相比Ba-Exo组中miR-222显著升高，由此这表明Ba-Exo可以通过miR-222促进M1巨噬细胞极化。本课题研究结果将为益生菌调节巨噬细胞成熟与极化机理的阐明提供新的理论依据，也将为免疫调节用候选益生菌的体外筛选提供新的思路和方法，并将提升我国饲用益生菌的应用基础研究水平。