牛心朴子和骆驼蓬根系水通道蛋白基因的克隆及抗旱机制对比研究

Researches on adaptive mechanisms of desert plants to the dry environment are very important to the recovery and reconstruction of vegetation in arid regions. But less attention has been paid to these researches at the molecular level. To make up this deficiency, we will use two typical desert plants of the northwest arid region, Cynanchum komarovii and Peganum harmala L., as objects of this study, and clone aquqporin genes (AQPs) from their roots. Then these genes will be analyzed from bioinformatics and gene expression. Primary understandings of AQPs shall be gotten via bioinformatics analysis, including identification, classification and making cladograms of nucleic acid sequences, and predicting the construction and function of amino acid sequences. The expression and distribution diagram of AQPs in roots shall be gotten via tissue-specific analysis. And candidate AQPs responding to drought shall be found via gene expression analysis under drought stress. Then AQPs having the drought-resistant function will be searched from candidate AQPs through examining the drought-resistant ability of RNAi/overexpression transgenic plants. Lastly, relationships between root AQPs of desert plants and drought resistance shall be obtained through contrasting all results of two study objects. So, this research can not only deepen knowledge about functions of AQPs on drought resistance in plants, but also add theoretical foundations on improving the environment of arid regions and provide good candidate genes to breed drought-resistant /tolerance crops.

荒漠植物干旱适应机制是干旱地区植被恢复与重建工作的研究重点，但其分子水平的研究尚未引起足够的重视。本项目以西北干旱地区两种典型荒漠草本植物- - 牛心朴子和骆驼蓬为研究对象，克隆其根系水通道蛋白（AQP）基因，然后分别进行信息学和基因表达分析。通过基因鉴定、分类、建树，以及蛋白质结构和功能预测等信息学分析建立对AQP基因的初步了解。再利用组织特异性表达分析作出基因在根系的具体表达分布图。然后通过干旱胁迫下的表达分析确定响应干旱胁迫的AQP基因，并利用基因沉默、基因过表达和转基因植株抗旱性检测等分析手段从中筛选出具有抗旱作用的AQP基因。最后，综合对比两种植物的所有研究结果，确立荒漠植物根系AQP基因与抗旱性的关系。该研究结果不仅有助于进一步理解AQP与植物抗旱性之间的关系，还可为西部干旱地区荒漠治理提供理论依据，并为耐旱作物培育提供优良的抗旱备选基因。

荒漠植物干旱适应机制的分子学研究是干旱地区生理生态学研究领域的弱项。鉴于此，本项目以西北干旱地区两种典型荒漠草本植物——牛心朴子和骆驼蓬为研究对象，对其根系质膜水通道蛋白（AQP）基因家族的基因进行了克隆和系统研究。生物信息学分析表明，这些基因分属于质膜内在蛋白（PIP），液泡膜内在蛋白（TIP），类Nod26膜内在蛋白（NIPs）和小分子碱性膜内在蛋白（SIPs）四大类：其中，PIP2亚类基因的数量远多于PIP1亚类，个别PIP基因具有不同的RNA剪切模式和较高的种内同源性，且在所研究的这两种荒漠植物中存在种间同源性；而其他三类AQP基因的种内同源性，以及在两种荒漠植物间的种间同源性都较差。由这些基因推测的氨基酸序列具有AQP蛋白的保守区域和结构特征，以PIP和TIP家族推测蛋白的保守性最高，而NIPs和SIPs家族推测蛋白的保守性较差。Real-time PCR结果显示：在牛心朴子和骆驼蓬中，绝大部分AQP基因在根系的表达量最高，茎次之，在叶片的表达量最低甚至不表达，但也有少量AQP基因在茎或叶的表达量最高，这可能与基因功能相关；这些根系AQP基因在干旱、高盐和低温胁迫下的表达均呈协同作用趋势，其中PIP和TIP家族成员对胁迫较为敏感，而NIP和SIP家族的基因受胁迫影响相对较小。就同一胁迫而言，这些AQP基因在所研究的两种荒漠植物中的转录水平表达量的变化差异较大；就同一植物而言，这些AQP基因在不同的胁迫条件下的转录水平表达量的变化差异也较大。仅在牛心朴子中发现一条PIP家族的基因（CmPIP2-5），在三种非生物胁迫下的表达量均显著增加。对该基因进行激素响应分析发现，GA、C2H4、ABA、SA、BRs和JA均能诱导其表达，但诱导能力呈递减趋势，且达到峰值的时间不同。CmPIP2-5基因在洋葱表皮细胞的瞬时表达确定了其定位于细胞质膜上。在烟草中过表达CmPIP2-5基因能明显提高植株的抗旱和抗盐能力，并赋予幼苗一定的抗寒性。生理生化数据显示，CmPIP2-5基因能提高烟草在不同胁迫条件下抗氧化酶系统活性，减少氧化损伤，并维持膜系统的稳定性。综上所述，该研究较为全面的揭示了水通道蛋白在荒漠植物干旱适应中发挥的作用，不仅为干旱地区荒漠治理提供了理论依据，还为抗逆育种提供了优良的候选基因。