维生素D受体基因转染血管内皮组细胞移植对载脂蛋白E缺乏鼠动脉粥样硬化影响及机制

内皮损伤是导致动脉粥样硬化(AS)的重要因素之一，我们发现维生素D受体(VDR)与内皮细胞(EC)功能异常及AS发生发展有关，且可能影响内皮祖细胞(EPC)功能。将VDR基因导入EPC移植治疗AS，可能为AS防治提供新的治疗途径和理论依据。我们拟用载脂蛋白(apo)E缺乏鼠为研究对象，从正常对照鼠骨髓中分离EPC，构建GFP标记的VDR与VDRmiRNA慢病毒载体质粒，观察VDR对EPC增生、凋亡、成血管能力以及血管平滑肌细胞(VSMC)增殖分化的影响。考虑到基质蛋白酶(MMP)2与血管损伤及VSMC增殖等有关，我们拟apoE缺乏鼠尾静脉注射VDR与VDRmiRNA慢病毒载体质粒，观察EPC定位分化、AS形成、VSMC增殖分化与迁移和动脉斑块MMP2表达变化，探讨VDR转染的EPC移植对AS形成的影响及可能机制。本研究将为AS、冠心病预防和治疗提供新的思路。

首先分离Wistar鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs),用CD131、CD133、VGFR、VEGFR2免疫荧光染色鉴定,构建GFP标记维生素D受体(VDR)、VDRsiRNA慢病毒质粒,脂质体转染EPCs,筛选阳性克隆,WB检测转染细胞VDR蛋白,RT-PCR检测mRNA,再将细胞分成rAd-VDR组、rAd-shVDR组、空白细胞组、rAD-VDR+Rapamycin组、rAd-shVDR+Rapamycin组、空白细胞+Rapamycin组,观察对EPCs增生凋亡及成血管能力影响,发现经抑制EPCs增殖迁移粘附及成血管能力Rapamycin处理的EPCs caspase3表达增加,Rapamycin和VDR影响细胞增殖,表明Rapamycin促进EPCs凋亡,高表达VDR抑制凋亡。进一步将载脂蛋白(apo)E缺乏鼠分为Con组、培养基组、空载体组、过表达组、干扰组,实验第4周末第8周末杀鼠,发现第4周末第8周末过表达组血总胆固醇、甘油三酯、低密度胆固醇、脂蛋白（a)浓度低于干扰组及其它组,高密度胆固醇(HDL)、apoA1、apoB高(P<0.01),8周末过表达组较4周末组HDL、apoA1高(P<0.01);4周末8周末过表达组主动脉基质金属蛋白酶的组织抑制物(TIMP)2、eNOS、iNOS mRNA较干扰组及其它组高,基质蛋白酶(MMP)2 mRNA降低(P<0.01),8周末过表达组较4周末组iNOS、TIMP2 mRNA高,干扰组TIMP2增高,eNOS、iNOS、MMP2 mRNA降低(P<0.01);4周末8周末过表达组小鼠主动脉TIMP2、eNOS、iNOS 蛋白表达较干扰组及其它组高,MMP2蛋白降低(P<0.01),8周末过表达组较4周末组iNOS、TIMP2 蛋白高,干扰组TIMP2增高、eNOS、iNOS、MMP2降低(P<0.01),4周末8周末过表达组小鼠血TIMP2、eNOS、iNOS、NO浓度较干扰组及其它组高,MMP2降低(P<0.01),8周末干扰组较4周末组TIMP2、eNOS、iNOS降低(P<0.01)。表明高表达VDR EPCs移植可有效治疗动脉粥样硬化,可能通过抑制细胞外基质合成、促进其降解,使eNOS基因与蛋白表达增高,NO合成与释放增加,有效清除活性氧自由基减轻血管损伤。