基于磁-劈裂适配体邻位连接和DNA纳米分子信标灯串的食源性致病菌分析微阵列的搭建

Foodborne pathogenic bacteria is one of the most important risk factor of food safety and a major threat to public health. Establishment of a rapid and sensitive detection method for early warning and control pathogenic bacteria is of great significance. This program uses the chemosynthetic and the thermostable split aptamer as the recognition element, which load into the super paramagnetic beads, to sandwich capture the bacteria cell by surface single binding site. Then, the bacteria can be converted to single peptide nucleic acid probe to anchor and output the DNA nano-string of fluorescence. This method can detect pathogenic bacteria quickly and sensitively without nucleic acid extraction. In consideration of the matching problem of antibody, this study intends to use the split aptamer for sandwich capturing bacteria by single site binding. To realize the fast and ultrasensitive signal output, we hybridize the molecular beacon to a DNA nanowire with a Domino interval, resulting a fluorescence signal via accelerated chain hybridization reaction. In order to achieve high-throughput analysis in complex samples, an compositive ‘Mother-Son’ analysis microarray is designed. Finally, we plans to establish a direct analysis method based on functional nucleic acids to realize the enzyme-free, extraction-free, culture-free detection of pathogen.

食源性致病菌作为食品安全最重要的风险因子之一，容易造成群体性危害，快速、灵敏的检测方法的建立对预警和控制致病菌危害具有重要意义。本项目拟选用可化学合成、热稳定的劈裂适配体作为识别元件，将其装载到磁响应性好的超顺磁珠上，通过菌表面单靶标位点夹心捕获待测菌，将菌转化为单链肽核酸探针，来强力锚定及点亮DNA纳米灯串输出荧光信号，实现致病菌的免培养、核酸免提取、快速、超灵敏检测。本研究为突破识别工具配对难的局限性，拟采用劈裂适配体首次实现单位点的夹心捕获；为实现快速和超灵敏的信号输出，模拟“多米诺骨牌”效应，将分子信标间隔杂交到DNA纳米线上，搭建加速DNA级联杂交反应体系，短时间内获得极强信号输出；为满足高通量复杂样本的分析需要，将分析方法集成为子母分析阵列；最终拟建立一种以功能核酸作为分析工具的、非酶依赖的、核酸免提取的、免培养的直接分析方法，为发展简便、快速的高灵敏分析方法提供了一条新思路。

食源性致病菌危害往往占据食品安全事件首位，快速、灵敏的食源性致病菌检测方法的建立对食源性疾病预警及保障食品安全至关重要。.本项目主要依托具有类抗体性质的核酸适配体及DNA纳米组装恒温扩增技术，搭建食源性致病菌的分析方法，实现致病菌的快速、灵敏检测。本项目的主要研究内容包括（a）食源性致病菌适配体库的丰富完善，（b）适配体的裁剪规律总结、劈裂研究及夹心捕获，（c）基于点击化学的核酸连接反应，（d）基于滚环扩增反应的纳米线制备，（e）基于加速级联杂交的DNA纳米信号灯串的搭建，（f）病原菌分析方法的搭建。.通过研究内容的有序落实开展，首先，新增适配体42条，共建立具有90条适配体的食源性致病菌适配体库，可以识别多种微生物全菌及组分；其次，总结了适配体的裁剪、劈裂规律，成功得到高亲和力的劈裂适配体一对，实现了劈裂适配体夹心捕获；第三，建立了Cu+介导的点击化学反应，实现了核酸连接；第四，制备出具有重复单元的长单链DNA纳米线；第五，快速制备得到了DNA纳米灯串；第六，建立了基于适配体夹心的病原菌双重比色传感方法。此外，在完成既定研究目标的基础上，还通过对微生物胞内基因电路设计改造，制备了一种靶标刺激乙烯气体产生作为检测信号的微生物全细胞生物传感器，为土壤污染物的现场检测提供了技术支撑。.本项目通过适配体的劈裂探究，化学无酶反应连接核酸，DNA信号元件降维快速组装等任务分解，成功制备了高亲和力劈裂适配体及可快速组装的DNA纳米信号灯串，为食源性致病菌高效分析方法的搭建提供了更多的“识别元件”及“信号元件”可能。