高三尖杉酯碱对AML作用的靶点筛选及联合阿克拉霉素的协同作用分子机制研究

我们在国际上首先应用HHA方案（高三尖杉酯碱HHT、阿克拉霉素ACR、阿糖胞苷Ara-c）治疗急性髓细胞性白血病(AML)获得很好的疗效。体外实验研究发现HHT通过上调Bax、激活caspase-3 诱导AML细胞株细胞凋亡、又发现通过抑制JAK2V617F与BCR/ABL等肿瘤蛋白引起的信号通路蛋白磷酸化而抑制AML细胞。进一步研究发现HHT与ACR联合应用对AML细胞株细胞具有协同抑制作用，并发现它们的一些作用靶点不同，提示两者的作用机制可能不同。但是它们的作用直接靶点是什么？两药的作用靶点是否互补？是多靶点还是单一靶点均不清楚。本课题拟通过基因芯片、2-D电泳、质谱分析及动物实验来确定药物作用的靶蛋白。并检测靶蛋白在AML及耐药AML中的作用。通过靶点的确定，将可设计更多的小分子药物，提供具有我国自主知识产权的抗AML靶向药物，具有重要的意义。

我们以往的研究发现以高三尖杉酯碱、阿克拉霉素、阿糖胞苷组成的联合方案治疗急性髓细胞白血病具有较高完全缓解率和总体生存率。为了证实高三尖杉酯碱（HHT）与阿克拉霉素（ACR）是否具有协同作用及作用的机制，我们在白血病体外及体内实验发现两药在抑制白血病细胞增殖、凋亡方面均具有协同作用。我们的研究发现HHT可能抑制AML细胞的PI3K/AKT信号并间接抑制WNT/β-catenin信号而杀伤AML细胞，ACR可能通过抑制AML细胞的WNT/β-catenin信号而杀伤AML细胞。两药联合可能通过同时抑制PI3K/AKT及WNT/β-catenin信号而协同杀伤AML细胞。但这些研究不能回答HHT的直接作用靶蛋白。. 为寻找HHT直接作用的靶蛋白，我们采用化学合成的方法合成出带上生物素标记的高三尖杉酯碱药物，利用链亲和素与生物素之间的高度亲和作用，将高三尖杉酯碱-生物素的合成化合物与链亲和素连接，形成高三尖杉酯碱-生物素-链亲和素的耦合，从而将药物固定在琼脂糖树脂柱上，为接下来寻找高三尖杉酯碱的作用靶蛋白的研究工作提供了一种方便有效的工具，这也是本试验研究方法中具有创新意义的重要步骤。并且，借由该亲和柱以及蛋白纯化和蛋白质谱技术，我们最终发现了高三尖杉酯碱作用白血病细胞时结合的直接靶蛋白为Myosin 9（又称NMHC-IIA）。我们还通过构建NMHC IIA高表达稳转细胞株、表达谱基因芯片分析、western blot和real-time PCR等方法对高三尖杉酯碱作用的可能分子机制进行探讨，结果表明高三尖杉酯碱能够通过结合并上调NMHC IIA蛋白，对细胞周期和MAPK通路上的多个成员产生影响，最终引起白血病细胞系周期发生改变并最终诱导细胞凋亡的发生。