Psi基因在美国白蛾性别决定通路中的功能研究

The sexual dimorphism is regulated by sex determination cascade. Loss-of function mutants lead to abnormal development even sterility which offers potential alternatives for the genetic management of insect pests. Studies on sex determination of Drosophila and Bombyx mori were well understood, however, there is no information on Hyphantria cunea, a key quarantine forest pest. Based on previous research in the silkworm, Bombyx mori, sex determination genes , Dsx, Psi, Ix and Tra2 have alternative splicing variants. And, Psi was involved in silkworm sex determination. We proposed that functional exploration of Psi will provide insight into the sex determination system in H. cunea. Our previous study demonstrated that CRISPR/Cas9 system could generate a comprehensive set of knockout mutations and we have obtained the genome data of H. cunea. In this study, H. cunea Psi (HcPsi) will be functional characterized comprehensively combining functional genomic tools with cellular biology techniques. Results generated from this proposed research will advance our understanding of the molecular mechanism of HcPsi on sex determination. Further, it will also provide targets genes for the genetic controls of this devastating forest pest.

性别决定是阶梯式调控过程，性别决定基因突变会影响物种性比甚至导致不育，具有应用于害虫防治的潜力。模式昆虫果蝇和家蚕性别决定相关研究较多，目前美国白蛾性别决定机制的研究未见报道。申请人以家蚕性别决定为基础，通过分析性别特异性剪接模式，发现Dsx，Psi、Tra2和Ix等在美国白蛾中存在可变剪接体。研究证明Psi基因参与鳞翅目家蚕性别决定，因此对美国白蛾Psi基因的功能解析可能是揭示性别决定机制的关键。申请人前期研究证明CRISPR/Cas9技术可以对美国白蛾进行高效基因组编辑，并且已获得基因组数据。因此，本项目拟采用CRISPR/Cas9技术和分子生物学方法，从昆虫整体和细胞层面研究探索Psi基因参与性别决定作用机理和分子机制，进一步阐明Psi基因参与美国白蛾的性别决定的作用机制，为美国白蛾防治提供靶标基因，为鳞翅目昆虫性别决定机制阐释提供新的思路，为发展害虫遗传防治理论提供有效途径。

美国白蛾（Hyphantria cunea）是重要的世界性检疫害虫，给我国林果业、养蚕业甚至农业造成惊人的损失，对生态系统造成巨大威胁。昆虫种群遗传调控因其物种特异性防控以及对环境友好，是害虫无公害可持续控制新方法。目前，对于美国白蛾遗传调控研究尚处于初期阶段。本研究通过转录组和基因组对其性别决定基因psi进行克隆，并利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，获得性别决定基因Hcpsi突变体。（1）在 Hcpsi基因的功能研究中，Hcpsi cDNA开放阅读框核酸序列包含2220bp，编码739个氨基酸，76.4kDa，等电点为6.876。Hcpsi序列包含昆虫psi典型结构特征，即含有4个KH domains和2个tandem repeats。通过靶向敲除KH-1 domain区域获得突变体。研究发现，在突变体中雄性出现性反转现象，其无法完成正常的交配和受精等生殖相关行为，造成性别特异性不育，表明该基因参与美国白蛾的性别决定通路；（2）在美国白蛾Hcdsx和Hcmasc基因功能研究中，发现Hcdsx和Hcmasc突变体出现生殖缺陷和性反转现象，表明Hcdsx和Hcmasc参与美国白蛾雌雄两性的性别决定通路，且Hcmasc参与剂量补偿通路；（3）由于现有的CRISPR/Cas9编辑效率低，我们分别开发了小型紧凑型的识别NNGG PAM的SauriCas9和识别N4C PAM的BlatCas9。本研究有助于揭示美国白蛾性别决定机制，也为害虫遗传防治奠定了理论基础，同时为非模式物种的基因功能研究提供新的工具。