p53对胆汁酸代谢酶的转录调控机制及其在胆汁淤积性肝损伤中的作用研究

The role of p53 in endogenous metabolism regulation emerges as a hot topic research in recent years. By genetic screening experiment，we firstly revealed that p53 could time-dependently up-regulate gene expression of bile acid metabolism enzymes Cyp3a11, Cyp2b10 and Sult2a1 in mice primary cultured hepatocytes, besides, in vivo experiments also confirmed that p53 agonist Doxorubicin could significantly decrease gallbladder volume and liver total bile acids level in mice, all of which indicated a novel role of p53 in bile acid metabolism. However, the detailed regulatory mechanism is not yet clear and whether it could contribute to attenuation of cholestatic liver injury still needs to be proven. Therefore, in the further study, p53 knockout mice will be introduced to directly demonstrate the role of p53 in bile acid metabolism, and we will verify the p53 function using intrahepatic and extrahepatic cholestasis mice models. Finally, in vitro experiments will be conducted to study the regulatory mechanisms of p53 on CYP3A4、CYP2B6 and SULT2A1 in four levels including activity, protein, mRNA and DNA response elements binding. Accomplishment of this research is expected to provide a scientific basis in elucidating pathogenesis and potential therapeutic target of cholestasis.

p53在内源性物质代谢中的调控作用是近年新兴研究热点，本课题前期研究通过基因筛选实验，首次发现p53能时间依赖性上调小鼠原代培养肝细胞中胆汁酸代谢相关的Ⅰ相代谢酶Cyp3a11、Cyp2b10以及Ⅱ相代谢酶Sult2a1基因表达，同时体内实验也证实p53激动剂多柔比星能明显减少小鼠胆囊体积及肝脏中胆汁酸水平，该结果初步证明p53在胆汁酸代谢领域存在调控作用。但是p53对胆汁酸代谢酶的具体调控机制及其在胆汁淤积性肝损伤中的作用尚未清楚。因此，本项目拟首先引入p53敲除小鼠直接证明p53对胆汁酸代谢的调控作用，然后通过肝内和肝外两个胆汁淤积模型研究p53激活对小鼠胆汁淤积性肝损伤的影响，最后通过体外细胞实验分别从酶活性、蛋白、mRNA以及与DNA应答元件结合能力四个方面研究p53对胆汁酸代谢酶的调控机制。本项目的完成将为进一步阐明胆汁淤积的发病机制及治疗靶标提供科学依据。

p53是重要的肿瘤抑制因子，近年研究发现p53能调控机体内源性物质的代谢，提示p53在非肿瘤性疾病中的重要作用。胆汁淤积是由于胆汁代谢和分泌功能紊乱或者胆道梗阻导致的胆汁酸在肝脏和体内产生潴留的一种代谢性疾病。胆汁酸稳态受到胆汁酸代谢酶与转运体的调控，本项目分别在细胞水平和动物水平研究p53对于胆汁酸稳态相关基因的影响，并考察p53后对胆酸所致肝内胆汁淤积的抵抗作用。 .本项目首先在小鼠原代培养肝细胞中，p53激动剂多柔比星（DOX）能显著性上调p21、 Cyp3a11、Cyp2b10、Sult2a1、Mrp2、Mrp3和Mrp4的mRNA表达水平，而且沉默p53后DOX对上述基因的上调作用被逆转至正常水平。同时，ABCC3 and.CYP2B6 (human orthologue of Cyp2b10)被鉴定为p53的直接调控靶基因。进一步的动物实验结果表明，激活p53能显著缩小胆囊，降低血清中ALP和TBA的水平，上调肝脏p21、CYP2B10、SULT2A1、MRP2、MRP3和MRP4的表达水平，而在p53敲除小鼠上没有观察到上述的变化情况。最后，我们采用胆酸诱导的肝内胆汁淤积模型考察p53对抗胆汁淤积的作用。结果表明，激活p53能显著对抗CA诱导的小鼠肝内胆汁淤积，具体表现在是胆囊形态正常化、显著降低血清ALP、TBA和Tbili的水平。代谢组学分析揭示，p53激活能够逆转CA所致的异常胆汁酸代谢谱，并显著增加胆汁酸稳态相关代谢酶和转运体如CYP2B10、SULT2A1、MRP2、MRP3和MRP4等的表达。而在p53敲除小鼠上则观察到CA所致胆汁淤积变严重的趋势，并观察到p53敲除小鼠肠道和肠内容物胆汁酸的丰度减少，提示p53敲除降低了淤积胆汁酸向肠道的外排。 .综上所述，本项目研究结果表明p53在促进胆汁酸分泌和缓解胆汁淤积综合征方面发挥了新的作用，提示p53可作为胆汁淤积性肝病治疗的潜在靶标。