水稻F-box蛋白OsFBX76调控粒重的分子机理研究

Rice grain yield and quality largely depend on grain weight. F-box proteins are components of E3 ubiquitin ligase S-phase kinase-associated protein, cullin, F-box containing complexes (SCF), which play an important role in grain size and weight control. Previously, a gene encoding a rice F-box protein was cloned and named OsFBX76. Transgenic rice plants overexpressing OsFBX76 showed reduced grain weight. The RNAi transgenic plants and CRISPR/Cas9 mutants showed increased grain weight. Yeast two-hybrid analysis confirmed that OsFBX76 could interact with OSK4, OSK15 and OSK20, which suggesting that OsFBX76 acts as a component of SCF complex to regulate grain weight in rice. In this project, the interaction among OsFBX76, OSK and Cullin will be confirmed by Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC), Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and Pull-down assays. The biological function of OsFBX76 will be validated through multiple biochemical, physiological and transcriptomics strategies. We will also identity the target substrate of OsFBX76 using yeast two-hybrid. This study will clearly illuminate the biochemical and molecular mechanism for OsFBX76 regulating grain weight by 26S proteosome pathway.

水稻粒重与产量和品质密切相关。F-box参与的蛋白酶体途径在调控水稻粒形和粒重方面发挥重要作用。申请者在前期的研究中克隆了一个编码F-box蛋白的基因，命名为OsFBX76。过表达该基因，粒重变小；RNAi转基因株系及突变体株系表现为粒重增加；酵母双杂交分析表明OsFBX76可以和OSK4、OSK15、OSK20相互作用。以上结果表明OsFBX76可能作为SCF复合体组分参与调控水稻粒重形成。本项目拟在此基础上，运用双分子荧光互补、免疫共沉淀和Pull-down等生化方法进一步验证OsFBX76是否参与形成SCF复合体；进一步对OsFBX76的遗传材料进行生理生化和转录组分析，解析OsFBX76的生物学功能；利用酵母双杂交筛选OsFBX76的靶蛋白，并进行验证。明确OsFBX76通过26S蛋白酶体介导的底物蛋白降解途径调控水稻粒重的分子机制。

为了解析水稻粒重调控的遗传基础，本项目以OsFBX76为研究对象，系统探究了其生物学功能和分子调控网络。该项目在前期构建并获得了以日本晴为背景的OsFBX76过量表达和RNA干扰转基因株系以及CRISPR/Cas9突变体株系，对获得的转基因和突变体株系研究结果表明：OsFBX76基因负调控籽粒的粒重。通过电镜观察和组织细胞学实验研究显示OsFBX76基因负调控细胞伸长，而非细胞分裂，进而影响水稻籽粒的大小，从而调控粒重。为了明确OsFBX76的靶蛋白，本项目利用该蛋白的PP2结构域对水稻不同发育阶段的穗文库进行了酵母文库筛选，并确定了其中一个候选蛋白，并将其命名为OsFIP1（OsFBX76 Interacting Protein 1）。OsFIP1与OsFBX76有着相同的表达模式，在幼穗中表达，且随着穗发育进程，表达量逐渐降低，OsFIP1蛋白在细胞核中表达。为了明确OsFIP1的功能，本项目构建了该基因的过表达系和突变体系。从结果可以看出，OsFIP1正调控水稻粒重。接着，本项目进一步利用免细胞实验来验证OsFIP1的降解途径，结果表明OsFBX76可以通过泛素化靶向降解OsFIP1。本项目综合利用分子遗传学和植物生理学等多学科交叉研究手段，解析了OsFBX76的生物学功能，系统阐明了OsFBX76协同OsFIP1调控水稻粒重的分子遗传机理，为利用分子生物学技术改良水稻产量和品质，培育优质高产水稻新材料提供了基因资源。