沙克乳杆菌PTP转运蛋白对胞外氨基甲酸乙酯前体瓜氨酸的转运及其调控机制

Citrulline is the main precursor of ethyl carbamate, which is a 2A carcinogen in alcoholic beverages and fermented condiment soy sauce. The elimination of citrulline is considered to be the most effective solution to remove the ethyl carbamate during the fermentation process. Some bacteria may utilize the extracellular citrulline through the arginine deiminase pathway into ornithine when the arginine in the extracellular is fully depleted. This is considered as the most effective way to utilize citrulline by bacteria. Throughout the entire utilization process, PTP transporters have been shown to play an important role in extracellular citrulline uptaken, but the function and transport mechanisms of PTP transporter still need to be studied in depth. At the same time, we found that the relative excess of arginine in the food fermentation system and some environmental factors also inhibited the uptake of extracellular citrulline. Therefore, through the in-depth study of the transportation and regulation mechanism of arginine and environmental factors on PTP transporter, it is helpful to achieve the control of citrulline in the fermentation system, thereby eliminating EC. In this study, highly efficient heterologous expression of PTP transporter, active reconstitution of PTP transporter into an artificial liposome, analysis of key gene expression and metabolic flux of ADI pathway, were used to comprehensively describe the transportation and regulation mechanism of uptake of extracellular citrulline by PTP transporter.

瓜氨酸是多种酒精饮料及发酵调味品酱油中生成2A级致癌物氨基甲酸乙酯（EC）的主要前体物，对瓜氨酸的消除被认为是此类发酵食品中去除EC的最有效方案。一些细菌在完全耗尽体系中的精氨酸后，能够将胞外瓜氨酸通过精氨酸脱亚氨基（ADI）途径转化为鸟氨酸，这被认为是细菌对瓜氨酸最有效的利用途径。在整个利用过程中，PTP转运蛋白已被证明在胞外瓜氨酸吸收过程中起到了重要作用，但其功能和转运机制均需深入研究。同时，申请人发现，食品发酵体系中相对过剩的精氨酸以及一些环境因子也会对胞外瓜氨酸的吸收造成抑制，因此，通过深入研究精氨酸和环境因子对PTP蛋白转运的调控机制，有助于实现对体系瓜氨酸的控制，从而消除EC。本课题拟以筛选获得的沙克乳杆菌作为出发菌株，通过PTP转运蛋白的高效异源表达和人工脂质体活性重组、ADI途径关键基因表达量分析及代谢通量分析等策略，综合阐述PTP转运蛋白对胞外瓜氨酸的转运及其调控机制。

瓜氨酸是多种酒精饮料及发酵调味品酱油中生成2A级致癌物氨基甲酸乙酯（EC）的主要前体物，对瓜氨酸的消除被认为是此类发酵食品中去除EC的最有效方案。一些细菌在完全耗尽体系中的精氨酸后，能够对胞外瓜氨酸进行利用，可作为发酵食品中EC的控制手段。PTP转运蛋白已被证明在胞外瓜氨酸吸收过程中起到重要作用，但其具体功能、转运驱动力、受环境因素的影响及在自然发酵菌株中的进化分布和作用等都还未有研究。通过在大肠杆菌Escherichia coli C43(DE3)中异源表达来自于Lactobacillus sakei的PTP转运蛋白，并研究其对胞外瓜氨酸利用和鸟氨酸积累的关系可以发现，PTP转运蛋白使E. coli C43(DE3)具有了之前所不具有的胞外瓜氨酸利用能力，但对胞外瓜氨酸的利用不与鸟氨酸的积累偶联，表明该转运蛋白并非瓜氨酸/鸟氨酸反向转运蛋白，其主要驱动力并非鸟氨酸。通过生物信息学分析及swiss-model建模可以发现，PTP转运蛋白的结构及预测模板与arcD所编码的arginine/ornithine antiporter存在较大差异。与PTP转运蛋白组成相似的蛋白，其功能一般为离子依赖型转运蛋白，而非氨基酸反向转运蛋白。基于此，研究了胞内外瓜氨酸浓度、NaCl浓度及pH对胞外瓜氨酸利用的影响，结果表明，胞内外瓜氨酸浓度梯度差，可显著影响重组菌株对胞外瓜氨酸的吸收和利用；发酵体系中NaCl浓度的升高影响了重组大肠杆菌对胞外瓜氨酸的利用，但这种影响主要是通过影响菌体生长，抑制了瓜氨酸的正常生理代谢；随着胞外pH的升高，瓜氨酸利用也获得了增强，这表明PTP转运蛋白是一个H+依赖型转运蛋白。通过设计获得了PTP编码基因的简并引物，建立瓜氨酸利用菌株的高通量筛选策略。利用该策略从环境中分离获得65株具有瓜氨酸利用能力的菌株，其中lactobacillus brevis PC4可在4 h内消耗体系中91.08 %的瓜氨酸。对分离菌株PTP编码基因进行分析可发现，lactobacillus sakei等四株菌的PTP编码基因都位于arc基因簇内，表明PTP蛋白的功能与分离菌株的瓜氨酸代谢途径密切相关。PTP蛋白是菌株胞外瓜氨酸利用的重要功能蛋白，对其转运功能和调控的研究可用于解决发酵体系中由瓜氨酸造成的EC积累问题。