新型糖类脂质体靶向基因载体的设计、合成及转染性能研究

The key techlonodgy for gene therapy is to design an effective and safe vector for targeted gene delivery. Based the merits of the liposomes gene delivery vectors and the potential targeting recognition capabilities of monosaccharide, a kind of novel glycolipids targeted gene delivery systems will be designed, synthesized in this proposal. The tansfection properties and targeted assay of those glycolipids gene vectors will be investigated. The correspondence between monosaccharides and targeting cells will be discovered by observing enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression from pEGFP-C1 plasmid in HEK293, 293FT, GES-1, GC-1, SW-480, HT-1080, U251, 3T3-L1, MCF-7, Hct-116, HUVEC, HeLa, A549, HBL100-SV40 and NIH3T3 cells. And a structure-activity relationship based on the chemical structure and physical structure of glucolipids gene delivery vectors will be established by evaluating the effects of the chemical structure and physical structure such as length of hydrophobic chain, length of the linkage between hydrophilic terminal and hydrophobic terminal, hydrophilic terminal types, hydrophilic terminal density, surface zeta potential, particle size and size distribution, on the transfection properties. This structure-activity relationship will be to provide a guiding theory for constructing new cationic liposome-based non-viral targeted gene delivery vectors and their application.

基因治疗的关键是构建高效、安全的靶向基因载体。本课题结合脂质体基因载体的优点和糖基靶向识别功能，设计并合成全新的糖类脂质体靶向基因载体，深入研究载体的转染性能与细胞靶向性。通过考察糖类脂质体载体携带绿色荧光蛋白基因质粒在各肿瘤细胞系内的表达情况，确定载体单糖结构与靶细胞之间的对应关系；通过考察糖类脂质体的疏水链长度、连接臂长度、亲水端种类和密度、表面电势、pH值、粒径大小及粒径分布等化学与物理结构参数对转染性能的影响，建立糖类脂质体基因载体化学结构和物理结构与转染性能和靶向性能之间的关系，并应用于糖类脂质体靶向基因载体系统以及其它类型的类阳离子脂质体靶向基因载体系统的设计，为新型糖类脂质体及其它类型脂质体非病毒靶向转基因载体的构建及其应用提供技术支撑。

本项目结合阳离子脂质体基因载体的优点和糖链的靶向识别功能，以葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和麦芽糖为母体结构，设计并合成近四十种糖类阳离子脂质体基因载体。通过核磁共振对各种糖类阳离子脂质体的化学结构进行了表征；测定了各种糖类阳离子脂质体的pH；测定了各种糖类阳离子脂质体及其DNA复合物的平均粒径、粒径分布和表面电势；用原子力显微镜对各种糖类阳离子脂质体及其DNA复合物的形貌特征进行了表征；用凝胶阻滞实验考察了各种糖类阳离子脂质体对基因的结合能力；用MTT法评价各种糖类阳离子脂质体的细胞毒性；通过考察糖类脂质体载体携带绿色荧光蛋白基因质粒在各种细胞系内的表达情况，确定载体单糖结构与细胞之间的选择对映关系；通过考察糖类脂质体的疏水链长度、表面电势、pH值、粒径大小及粒径分布等化学与物理结构参数对转染性能的影响，建立糖类脂质体基因载体化学结构和物理结构与转染性能之间的构效关系。结果表明：1) 具有双疏水链、疏水链长度为C12-C16、双疏水链不与糖环直接相连而与亲水端相连是高效、安全的糖类阳离子脂质体基因载体的前提条件；2) 各种糖类阳离子脂质体及其DNA复合物的pH、平均粒径、粒径分布和表面电势对基因转染性能影响甚微；3) 各种糖类阳离子脂质体水溶液本身的表面电势对脂质体结合基因的能力影响较大；4) 各种糖类阳离子脂质体的细胞毒性较小，毒性优于或相当于商用转染试剂Lipo2000；5) 基因转染效率表明各种糖类阳离子脂质体转运EGFP的效率表明对细胞具有一定的选择性。将上述糖类脂质体基因载体系统的构效关系规律推广至其它类型的类阳离子脂质体基因载体系统的设计，设计并合成了以氨基酸、季戊四醇、三羟甲基丙烷和丙二醇胺为母体结构的阳离子脂质体基因载体，通过对他们的基因转染活性评价验证上上述构效关系的正确性与谱适性。项目的研究结论为新型糖类脂质体及其它类型脂质体非病毒基因载体的构建及其应用提供了理论和技术支撑。