基于质谱技术的荷叶多酚抑制AGEs形成的分子基础及作用机制研究

Previous research indicated that lotus leaves polyphenols extract can effectively inhibit the formation of advanced glycation end-products (AGEs), but the exactly functional compounds and inhibition mechanism are still unknown. Therefore, this project aims to construct the finger-print of AGEs inhibitors that present in lotus leaves by ultrafiltration and high-resolution mass spectrometric techniques with ovalbumin and β-lactoglobulin as materials. Then, chromatographic separation will be applied to purify the AGEs inhibitors targetedly using finger-print guided isolation, and the structures will be elucidated with nuclear magnetic resonance, et al.. Effect of purified inhibitors on the glycation progressing will be studied by physical and chemical analytical techniques, the inhibition kinetics on AGEs formation will also be built by statistical approaches. Changes in the multi-structures and spatial conformation of natural and glycated proteins will be investigated by spectroscopic and spectrometric techniques. Spectrum techniques such as LC FTICR MS will be employed to investigate the influence of inhibitors on the glycation sites and degree of protein. Finally, the functional compounds and inhibition mechanism of lotus leaves polyphenols extract on the formation of AGEs will be revealed. The practice of this project will be meaningful to complement the theoretical system of natural products inhibiting AGEs formation and to the directional control of AGEs formation during food processing.

前期研究发现，荷叶多酚提取物能有效抑制晚期糖基化终产物（Advanced glycation end-products，AGEs）的形成，但其具体作用成分和抑制机制还不明确。因此，本课题以卵清蛋白和β-乳球蛋白为研究对象，采用超滤和高分辨率质谱等技术构建荷叶中AGEs抑制剂的指纹图谱；利用色谱分离技术靶向分离纯化荷叶中的AGEs抑制剂，并采用核磁共振等技术精确表征其结构；借助理化分析技术研究抑制剂对糖基化反应历程的影响规律，并构建其抑制动力学模型；采用荧光等光谱和HDX MS等质谱技术阐述抑制剂对天然和糖基化蛋白多级结构和空间构象的变化规律；通过LC FTICR MS等质谱技术研究抑制剂对蛋白质糖基化位点和糖基化程度的影响，最终探明荷叶多酚抑制AGEs形成的具体作用成分及抑制机制。本课题的实施对完善天然产物抑制AGEs形成的理论体系和食品加工过程中AGEs的定向调控具有重要意义。

荷叶是我国著名的药食同源性植物，具有很好的保健功能，晚期糖基化终产物（AGEs）是蛋白质与还原糖经糖基化反应产生的一类有害化合物的总称，其在人体中的积累会增加糖尿病并发症、动脉粥样硬化、老年痴呆症、尿毒症、白内障等慢性疾病的发生概率，膳食是人体内 AGEs最主要的来源。我们前期研究发现，荷叶多酚提取物能有效抑制AGEs的形成，但其具体作用成分和抑制机制还不明确。因此，本项目以卵清蛋白（OVA）、β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）为模式蛋白，优化了荷叶中 AGEs的提取富集方法，制备富集组分，并采用质谱技术构建了主要化学成分的指纹图谱；采用植物化学和NMR等核磁技术对活性成分的结构进行了精确表征；采用光谱、质谱和分子对接等技术阐述了代表性AGIs对蛋白质糖基化过程、构象结构、糖基化位点的影响极其相互作用机制。. 通过研究发现，荷叶中AGEs的最佳提取条件为：料液比1:30（g:mL），乙醇浓度为70%，超声时间为40 min，超声温度为50℃，超声功率为400 W，然后采用XAD-16大孔吸附树脂进行分离富集，收集80%乙醇洗脱组分。其主要成分为金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷和紫云英苷，其中异槲皮苷的活性最高。Q3G能显著抑制α-La-果糖体系的早期、中期和晚期糖基化过程，对晚期的抑制效果最为明显，最终抑制有害产物的形成和积累。同时，Q3G与OVA、β-Lg和α-La按照1:1的摩尔比结合形成了稳定的复合物，其结合是一个自发的吸热过程，氢键、疏水相互作用和范德华力是其主要作用力，且Q3G通过静态的方式淬灭OVA、β-Lg和α-La荧光团，改变发色团附近的微环境。同时减弱糖基化反应诱导的OVA、β-Lg和α-La构象变化，抑制糖基化蛋白的交联，从而影响氨基酸残基与果糖的结合，显著抑制OVA、β-Lg和α-La的糖基化过程以及AGEs的形成。另外，Q3G会降低OVA、β-Lg和α-La上潜在糖基化位点的糖基化反应活性，改变糖基化位置，降低大部分位点的糖基化程度，达到延缓非酶糖基化和减少有害糖基化产物形成的效果。荷叶黄酮富集组分抑制AGEs形成的机制与Q3G相同。. 本项目的研究结果可为荷叶资源的高值化利用和食品加工过程中AGEs形成的定向调控提供理论支持，同时对完善天然活性成分抑制AGEs形成的理论体系也具有一定意义。