拟南芥ANAC060抑制果糖特异信号分子机理的研究

Recently, glucose sensor HXK1 independent fructose signaling has been approved in plant. This opened a new field in the research of plant sugar signaling. Based on the identification of a novel gene specificlly repressing fructose signaling, ANAC060, the approach of molecular genetics, functional genomics, biochemistry and plant physiology will be used to identify the key factors involved in ANAC060 regulating fructose signal transduction. The interactions between ANAC060 and ABA synthesis and ABA signaling will be studied using the double mutants of anac060 and ABA defecient and ABA signaling. Microarray, yeast two hybrid and ChIP-seq will be used to indentify the downstream and target genes of ANAC060 and its interaction genes. The fructose sensing phenotypes of the mutants or the overexpression lines and the protein function of these genes will be investigated to illustrate to regulatory network and molecular mechanism. This project will demonstrate the molecular mechanism and phyological function of fructose signaling, and one hand to improve our knoweloge of sugar sigaling regulating metabolism especially in synthesis, transport and storage of carbohydrate in plant, and in the other hand, to illustrate the relation between sourse and sink in crop and to provide theoritical base for optmizing the sourse sink relationship for inproved the crope yields.

最近，独立于葡萄糖感受体HXK1的果糖信号的证实，为植物糖信号研究开辟了新领域。本研究在筛选到一个新的特异抑制果糖信号的基因ANAC060的基础上，综合分子遗传学、功能基因组学、生物化学、植物生理学等研究手段，重点鉴定ANAC060调控果糖信号转导途径的关键因子。通过构建与ABA缺陷和ABA信号的双突变体，研究ANAC060与ABA合成、信号的互作关系，采用基因芯片、酵母双杂及CHIP-Seq等手段，系统研究ANAC060转录因子的靶基因、下游基因和互作蛋白，研究这些基因的突变体或过表达的果糖敏感表型，以及这些基因的蛋白质功能，揭示ANAC060抑制果糖信号的调控网络和分子机理。本研究将进一步揭示果糖信号传导的分子机理和生理功能，一方面提高我们对植物糖信号调控代谢特别是碳水化合物的合成、运输和储存的认识，同时为阐明农作物源库关系的调控机制，为最终优化源库关系进而提高作物产量奠定理论基础。

我们通过qPCR，发现ANAC060基因主要在苗期表达，成熟期主要在根中表达，另外在叶、茎、花和果荚中有少量表达；该基因的表达也受渗透压和糖处理的诱导。通过构建ANAC060启动子驱动GUS转基因植株的GUS染色，发现ANAC060主要在子叶和胚轴中的脉管区域以及侧根形成部位表达。通过荧光素酶片段互补实验发现ANAC060能形成二聚体，其N端二十个氨基酸对是形成二聚体所必需的，ANAC060对靶基因的调控作用依赖于其自身形成的同源二聚体结构。通过酵母双杂实验，筛选出AT1G70320、AT1G31330、AT4G02380、AT4G17390、AT1G29930、AT5G15200、AT1G68010、AT3G09210、AT3G26710等ANAC060的候选互作蛋白基因。通过转录组基因芯片分析，在野生型和anac060突变体或糖和渗透压对照之间共发现8350个上下调基因。其中大部分基因在anac060突变体中受到糖上下调的程度远高于在野生型Col中受到糖上下调的程度。可以推断ANAC60主要在糖信号当中起到信号强度衰减作用。对既受糖处理调控，又受ANAC060调控的基因进行了GO分析，发现糖下调且在anac060突变体中下调的基因富集在叶绿体内囊体、光合作用等方面上面。而糖上调且在anac060突变体中上调的基因富集在脱落酸响应、种子休眠、种子萌发等方面。利用GFP蛋白的抗体对糖处理的35S:ANAC060-GFP转基因株系进行CHIP-seq分析,总共鉴定到2464个ANAC060结合位点，对ANAC060结合序列进行分析，鉴定出ANAC060的结合保守基序CACGTG。综合基因芯片和CHIP-seq分析结果，发现ANAC060能同时抑制和激活不同功能的基因。通过CHIP-qPCR、EMSA和瞬时表达分析，证实了ANAC060直接抑制了糖-脱落酸途径重要的基因ABI5的表达，直接上调了参与质体-核信号并影响糖敏感GUN5的表达。我们还发现anac060Xaba2、 anac060Xabi4 及anac060Xabi5双突变体表现出糖不敏感表型。.通过本项目的资助，申请人在作为通讯作者在SCI期刊《PLoS Genetics》、《J EXP BOT》发表研究论文2篇，在《植物生理学报》发表综述论文一篇，培养了博士1名、硕士2名。