精子形成相关基因Fscb敲除小鼠模型建立及其表型研究

纤维鞘是精子鞭毛主段所特有高度有序装配糖酵解酶和信号转导通路组分的独特骨架结构,类似电子转运链，在糖酵解，蛋白磷酸化和运动之间发挥"穿梭"作用，调节鞭毛运动。申请者前期发现一种具有钙结合能力且在获能过程中磷酸化的重要纤维鞘特异蛋白FSCB，并在自然基金支持下，深入研究了其磷酸化及蛋白相互作用，亦发现畸形精子中存在FSCB明显异常表达。该蛋白是否为精子鞭毛运动所必须？缺乏该蛋白将导致精子功能何种改变？该蛋白在精子纤维鞘上发挥何种作用？为此，本课题拟应用基因敲除技术敲除全长Fscb基因，利用新型载体pCJU-KO/FRT NEO DT构建打靶载体，并获得基因敲除小鼠，应用精子质量和运动分析，体内外受精分析，二维电泳，Western blot，免疫组化，质谱等鉴定Fscb基因敲除小鼠的表型特征。其重要意义不但可揭示Fscb基因基本生理作用，而且可能提供全新的阻断精子FSCB功能进行避孕的新靶点。

研究背景与目的：纤维鞘钙结合蛋白(Fibrous Sheath CABYR-binding protein，FSCB) 是申请者本人首先发现并鉴定的一种精子特异性表达的新蛋白，前期研究证实FSCB是一种在精子形成过程中特异性表达并最终定位于精子鞭毛纤维鞘的环状肋板和纵形柱状体表面上的蛋白，该蛋白具有睾丸/精子特异性，具有保守的PXXP 基序，伸展蛋白样区域和脯氨酸富积区，同时具有钙结合能力，并且其丝氨酸/苏氨酸在体内外均可被蛋白激酶A（PKA）磷酸化。而且证实FSCB蛋白与AKAP4在表达的时相性和定位方面具有高度相似性，因而推测FSCB蛋白很可能是参与精子鞭毛运动，与精子获能和超活化相关的重要蛋白。本研究的目的是进一步阐明FSCB蛋白在精子形成和运动中的功能。方法：应用CRISPR/Cas9系统构建鼠Fscb基因打靶载体，敲除Fscb基因全长，建立Fscb基因敲除动物模型。然后应用该动物模型，通过精子质量和运动分析，体内外授精分析，Western blot，免疫组化等鉴定Fscb基因敲除小鼠的表型特征，从而深入研究Fscb基因缺失对雄鼠生育能力的影响。结果：首先应用CRISPR/Cas9系统成功建立了Fscb基因敲除动物模型，应用敲除Fscb基因的纯合子小鼠，通过Western blot 分析证实纯合子雄鼠睾丸及精子内的FSCB蛋白表达消失，免疫荧光观察显示纯合子小鼠睾丸组织及精子中均无FSCB蛋白表达，证实基因敲除成功。对野生型、杂合子和纯合子小鼠精子的存活率、各项运动参数对比分析显示均无显著差异，无统计学意义（P>0.05）；体外受精实验显示：各组雄鼠精子与透明带结合的平均数、透明带完整卵细胞的授精率、与无透明带卵结合的精子平均数均无显著差异（P均>0.05）。小鼠体内受精能力分析显示，野生型、杂合子与纯合子雄鼠所对应的交配雌鼠的受孕率，怀孕胚胎数、自然产仔数，各组间均无显著差别（P>0.05),各组子代成年雄鼠生殖腺发育也无明显差异。应用各组小鼠精子，观察其获能前后的磷酸化情况，显示组间也均无显著差异。结论：Fscb基因敲除后，雄性小鼠精子的运动功能及体内外受精能力无明显变化，表明该基因所编码蛋白的功能对于精子运动和授精能力的维持可能是非必需的或可被替代的。