以秀丽线虫为模型对癫痫发病相关microRNAs的筛选、鉴定和功能分析

筛选和鉴定癫痫发病相关的miRNAs对于揭示癫痫病因非常关键。秀丽线虫与人类的神经功能基因具有较高的保守性，miRNAs也具有一定的同源性，并已具备癫痫基因筛选模型。因此，以线虫为模型进行该研究，较哺乳动物更有优势。本项目将首先利用miRNAs缺失的线虫品系库，通过PTZ和aldicarb分别诱导的方法，对癫痫发病相关的miRNAs进行筛选；然后利用荧光蛋白报告基因载体，对已筛选出的miRNAs在线虫发育中的组织表达和亚细胞分布形式进行定位；接下来，利用Ago蛋白pull-down和以SRM为基础的定量靶向蛋白质组学技术相结合的方法，确定癫痫发病相关miRNAs的靶mRNAs；最后，通过获得miRNAs/mRNAs结合位点突变的转基因线虫，分析miRNAs/mRNAs相互结合对靶mRNAs表达及功能的调控作用。通过以上研究，发现癫痫发病原因中新的遗传学分子，为癫痫的治疗提供新的理论基础。

癫痫由于致病原因不明治疗效果极不理想。miRNAs是大约22个核苷酸长度的非编码小RNA，通过与靶mRNAs的3'UTR相互作用，抑制靶基因的表达。已有研究发现，miRNAs在神经系统尤为富集，而且与神经系统的很多生理过程有关，包括神经分化，轴突生长，突触可塑性。以癫痫大鼠为模型的研究发现，癫痫发病可能与miRNAs密切相关。因此筛选和鉴定与癫痫发病相关的miRNAs对于揭示癫痫病因非常关键。秀丽线虫与人类神经功能基因具有较高的保守性，miRNAs也具有一定的同源性。2004年Cody J. Locke研究组发现，lis-1基因突变的线虫在药物PTZ（pentylenetetrazole）的诱导下表现出类似于人类癫痫的头部快速摆动的表型。因此，本项目以线虫为模型，利用miRNAs缺失的线虫品系库，开展了癫痫发病相关的miRNAs的筛选和鉴定工作。通过10mg/mL PTZ诱导癫痫模型，以及乙酰胆碱酯酶抑制剂aldicarb的处理实验，我们确定了最古老的动物miRNA家族，miR-100家族的成员之一，miR-51在癫痫发病中的重要作用。而该家族的其他成员与癫痫发病无关。另外，我们发现miR-51基因的缺失能够引起线虫GABA神经元生长的缺陷，这可能正是导致miR-51突变体线虫GABA神经递质传递下降的原因之一。接下来，我们利用生物信息学技术对miR-51的靶基因进行了预测。并通过RT-PCR以及荧光素酶双报告检测确定glo-4为miR-51的一个靶基因。进一步的双突变实验结果表明，miR-51在PTZ诱导癫痫发病的过程中依赖于glo-4。Glo-4是一种Rab GEF。YiShi Jin研究组已报道，Glo-4与靶Rab GTPase Glo-1组成的GLO pathway被激活后可以影响突触囊泡的运输，并改变突触形成和神经元生长。因此，目前我们正在对miR-51是否通过Glo-4改变GABA神经突触囊泡的运输进行进一步确认。另外，miR-51以及 glo-4 3'UTR序列的转基因工作目前也正在进行中。相关的研究成果将在2014年整理并发表。该研究成果将是对miRNA通过突触囊泡运输参与癫痫发病进行的首次揭示，将为癫痫发病的分子机制研究奠定一定的理论基础，并为癫痫的治疗提供新的线索。