新生小鼠支持细胞中蛋白质的异戊二烯化改变导致成年雄性生殖障碍的研究

The Sertoli cells play a critical role during spermatogenesis by forming blood-testis barrier (BTB) between Sertoli cells and constitutively expressing inflammatory cytokines to protect germ cells from the attack of immune system. Any assault against Sertoli cell during human childhood like mumps infection would result in adult infertility because there is no BTB between Sertoli cells. We have found that conditional knockout geranylgeranyl diphosphate synthase 1 (GGPPS) gene in testicular Sertoli cell of mice could lead to adult infertility. The testis weight of KO mice was significantly decreased comparing with their littermates from as early as 1 week. NF-κB was found constitutively activated in KO Sertoli cells. GGPPS converted the FPP to the GGPP, both of which are used for the prenylation modification of the proteins with CaaX motif in their carbon terminals, like RAS GTPases superfamily. This modification enhances the hydrophobicity of the protein and facilitates its interaction with hydrophobic environments like cellular membranes or certain protein domains. In the proposal, we will first further analyze phenotype of Sertoli cell specific GGPPS knockout mice, and then to study whether and how protein prenylation in Sertoli cells can affect testes development and spermatogenesis during childhood of mice.

哺乳动物睾丸支持细胞在精子发生中发挥重要作用。支持细胞在性成熟时形成血睾屏障(BTB)，并分泌免疫调控因子，以保护发育的精子细胞免受自身免疫系统的攻击。然而在性成熟前支持细胞之间并不存在BTB，因此包括腮腺炎病毒感染在内的睾丸损伤更易对睾丸发育和精子发生造成伤害，甚至引起成年雄性不育。我们发现，在小鼠睾丸支持细胞中特异敲除香叶基香叶基二磷酸合成酶(GGPPS)导致成年雄性小鼠不育。分析表明出生后7天性成熟前敲除小鼠睾丸显著小于野生小鼠，精子发生障碍并伴随炎症通路NF-κB活化。GGPPS以法尼基二磷酸(FPP)为底物合成香叶基香叶基二磷酸(GGPP)，两者都可用于异戊二烯化修饰包括Ras在内的小G蛋白，提高他们的疏水特性和膜结合能力。本课题将在详细分析敲除小鼠表型的基础上，进一步从细胞水平和个体水平研究GGPPS介导的支持细胞蛋白质异戊二烯化修饰在小鼠性成熟前对睾丸发育和精子发生的影响。

精子发生是一个受到高度调控的复杂过程，支持细胞在精子发生过程中为精原细胞的自我更新和分化提供营养和结构支持，并在小鼠青春期时形成血睾屏障（BTB），分泌免疫调控因子以保护发育中的精子细胞免受自身免疫系统的攻击。香叶基香叶基二磷酸合成酶（GGPPS）作为甲羟戊酸途径中的一个重要分支酶，以15个碳的法尼基焦磷酸（FPP）为底物合成20个碳的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。FPP和GGPP能修饰具有CaaX序列的小G蛋白，如Ras,Rho,Rac 等小G 蛋白。我们发现有腮腺炎感染病史的不孕不育病人中睾丸的GGPPS的启动子区域甲基化水平明显升高，引起GGPPS的表达显著下降，同时，H-RAS 的异戊二烯化修饰也出现明显的上升。在支持细胞中特异敲除GGPPS后引起雄性不育，在出生7天后生精小管就出现萎缩，精原细胞大量减少。由于BTB在小鼠出生后2周才开始形成，没有BTB的保护，新生小鼠中支持细胞分泌的炎症因子和趋化因子显著上升并导致精原细胞凋亡和巨噬细胞的管腔侵润。巨噬细胞的管腔侵润将对攻击未来发育进入管腔的精子细胞，进一步抑制了成年小鼠的精子发生，导致成年小鼠的不育，解释了儿童期腮腺炎感染影响成年男性生殖功能的原因。进一步的研究发现，GGPPS敲除后导致睾丸炎症的发生是由于FPP水平上升，显著增强H-Ras的法尼基化修饰，从而导致MAPK 和NF-κB通路的组成性活化。另外我们还在精原细胞中特异敲除了GGPPS，发现精原细胞自我更新和分化的平衡被打破，精原细胞提前进入分化，从而出现精原细胞库的枯竭，导致雄性不育的发生。这种变化也是由于FPP的积累导致Rheb法尼基修饰的升高，从而激活了mTOR信号，使精原细胞提前进入分化。综上所述，我们的研究显示GGPPS通过影响FPP和GGPP水平的变化，导致蛋白异戊二烯化平衡的改变，在精子发生发挥功能。我们的结果为临床中解决不孕不育提供新的思路。