根茎型清水紫花苜蓿根茎性状发生的分子机制研究

At present, molecular breeding has become a hot spot in alfalfa breeding. Tap-rooted alfalfa has been achieved in abiotic stresses, biotic stress and quality improvement, and creeping rooted alfalfa has been achieved in morphology, genetic and molecular biology,molecular mechanism and regulation gene of rhizomatous rooted alfalfa is still unclear. Rhizomatous rooted alfalfa is a relative independence germplasm resource, there is bigger genetic distance between rhizomatous rooted alfalfa and international registry other' alfalfa varieties, it is an important genepools of alfalfa breeding and improved varieties. Therefore, taking the rhizomatous rooted Medicago sativa L. cv. Qingshui as the material, to take the Medicago truncatula as the control, the transcriptomic of library rhizomatous rooted and nonrhizomatous rooted will be construct, respectivelly.To analyze the library transcriptome with next generation sequences (RNA-seq). Researching the expression of differential gene through cDNA-SRAP technology in order to search the molecular mechanism of rhizomatous rooted alfalfa and finding the relevant excellent gene, which not only would promote leguminous plant genetic and genomics but also would exploit gene resources of rhizomatous rooted alfalfa, which will important to promote breeding and quality improvement of alfalfa.

目前分子育种是苜蓿育种研究的热点，对直根型苜蓿的研究已在抗非生物胁迫、抗生物胁迫和品质改良等方面取得了重要进展，对根蘖型苜蓿已在形态学、遗传学、生理机制及分子生物学等方面进行了深入研究，但对根茎型苜蓿根茎性状发生的分子机制及调控根茎性状发生的相关基因仍不清楚。根茎型苜蓿作为一相对独立的紫花苜蓿种质资源，与世界上已登记苜蓿品种的遗传距离较大，是苜蓿育种和品种改良的优异种质资源。为此，本研究拟以根茎型清水紫花苜蓿为供试材料，以蒺藜苜蓿基因组为对照，采用RNA-Seq技术对根茎与非根茎样本转录组进行解析，得到与根系相关的差异表达基因；用GA对根茎型苜蓿进行诱导处理，结合cDNA-SRAP技术对与根茎性状相关的差异基因进行分离，旨在揭示控制根茎性状发生的分子机制并挖掘优异基因，不仅可促进豆类植物遗传和基因组学研究，而且对于挖掘我国根茎型苜蓿优异基因资源，促进苜蓿新品种选育和品质改良也具有重要意义。

苜蓿的根系类型可划分为直根型、侧根型、根蘖型和根茎型4类。根茎型，根颈距地表相对较低，并从其主根的中轴发育出类似根状的茎，萌发出营养枝，既可用于放牧型苜蓿草地的建植，又可作为刈割草地用苜蓿草种。根茎型清水紫花苜蓿是我国第一个通过国家审定的根茎型苜蓿品种（品种登记号：412），有许多其他紫花苜蓿品种所没有的植物学特征和生物学特性。. 在甘肃天水麦积（半湿润）、兰州榆中（半干旱）、武威黄羊镇（干旱）3个不同地区对清水紫花苜蓿根茎性状的表达率进行调查，其播种当年和种植第二年根茎性状未表达，3年后清水紫花苜蓿结荚期在天水根茎率最高，为76.7%，兰州次之，为43.5%，武威最低，仅39.0%；苜蓿根状茎的发育与土壤水分、温度有密切关系，在气候湿润温暖、土壤水分长期充足的条件下，根状茎发育强烈。根茎率在3个生态区均未100%表达，既与种植年限有关，又与小环境影响有关。苜蓿根茎性状是遗传和环境相互作用的结果。在遗传性方面，根茎性状属于复杂的数量性状，遗传力较低，受环境影响较大。.利用RNA-seq技术，对清水紫花苜蓿根茎与非根茎部位进行转录组分析，差异表达基因共有3260个，其中上调表达基因144个，下调表达基因109个。GO、KOG和KEGG富集分析表明，差异表达基因主要富集的生物进程和代谢通路有：光合作用、光合碳固定、光合作用-天线蛋白、淀粉和蔗糖代谢以及碳代谢。发现AP2-EREBP、AUX、Dof、Hsp、NAC、Bheh、Bzip、CAAT、Tif、Vea、MAPK等转录因子在苜蓿根茎芽形成过程中起重要调控作用，且Hsp70基因应答数量最多，其次是Bzip、AP2-EREBP。. 对Hsp70基因进行深度分析发现，其在能量代谢和跨膜组分中起开关的作用，其蛋白的不同构型决定了代谢通路的方向。运用RACE技术和RT-PCR技术就Hsp70基因的结构和丰度进行深入研究，证实Hsp70基因在根茎与非根茎部位的表达量差异显著，高表达其根状茎发育强烈，该基因在苜蓿6号染色体上26538338-26539007位置，基因的大小为169 bp，隶属于HSPB家族，同源基因为蒺藜苜蓿Mt ERF0521。