集免疫检查点PD-L1与CTLA-4双重阻断和光动力治疗于一体的纳米系统治疗肿瘤的研究

Immune checkpoint blockade combined with radiotherapy has synergistic therapeutic effect on treatment of malignant tumor. Considering side effect of radiotherapy, we propose to replace radiotherapy with safer photodynamic therapy. The photodynamic therapy can kill the orthotopic tumor cells and release tumor specific antigen. Concomitantly, immune checkpoint blockade can reverse tumor immunosuppressive microenvironment, synergize the photodynamic therapy to activate immune cells and induce robust host antitumor immune response. Aiming to this, we will design a new light-controllable nanosystem for drug delivery. We will use thermos-sensitive nanoparticle to load pheophorbide-a which can exert photothermal conversion effect under a 808-nm laser to trigger tumor-specific release of anti-PD-L1 antibody and anti-CTLA-4 antibody for immune checkpoint blockade therapy. Following tumor cell uptake, pheophorbide-a can also act as a photosensitizer under 660-nm light irradiation for photodynamic therapy. This combinatorial therapy shows promise to enhance therapeutic efficacy to treat both orthotopic and metastatic tumors and reduce side effects. We will further investigate the mechanism of synergistic effect of PD-L1 and CTLA-4 dual immune checkpoint blockade with photodynamic therapy to elucidate the rationale of this combinatorial therapy. The design of such nanosystem has not been reported by other groups. Our preliminary results proved the feasibility of this design and showed its synergistic antitumor therapeutic effect.

免疫检查点的阻断治疗与放射治疗对恶性肿瘤产生协同疗效。针对放疗引起的毒副反应，本项目提出采用更为安全的光动力疗法替代放疗的设想：利用光动力疗法杀伤原位肿瘤细胞，释放肿瘤特异性抗原；通过免疫检查点的阻断逆转肿瘤免疫抑制性微环境，协同光动力疗法激活免疫细胞，诱导宿主产生强烈持久的免疫应答。由此设计一种新颖的光控纳米载药系统：以热敏纳米粒中脱镁叶绿酸-a对808-nm激光的光热转化效应，触发抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体在肿瘤内定位释放，实现抗体对免疫检查点的阻断；脱镁叶绿酸-a被肿瘤细胞摄取后，经660-nm激光照射，亦发挥光敏剂作用，实现光动力治疗。该协同疗法有望显著提高对原位及转移瘤的治疗效果，降低毒副作用。探寻PD-L1和CTLA-4双重阻断联合光动力治疗肿瘤的协同机制，有望阐明该联合疗法的理论依据。该纳米系统的设计思路未见报道，预实验结果初步证实设计方法可行，协同抗肿瘤效果良好。

免疫检查点抗体阻断疗法对于恶性肿瘤的治疗取得了很好的临床疗效。然而，患者对于单一的免疫检查点阻断治疗的总体有效率仅为20-30%。如何将现有的临床治疗方案与免疫检查点抗体阻断疗法相结合，发挥协同的治疗作用，是亟需解决的临床问题。肿瘤的光动力治疗是成熟的临床治疗方案，其对局部肿瘤的治疗产生很好的疗效。本项目设计并制备了两种载抗程序性死亡受体-配体1 抗体（αPD-L1）和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白抗体-4（αCTLA-4）同时载光敏剂的纳米给药系统。制备了载抗体和脱镁叶绿酸-a（Pa）的脂质体纳米递药系统，并表面链接cRGD多肽。cRGD-PaNPs平均粒径为178 nm，在磷酸缓冲液（PBS）和10%的血清中稳定。利用抗体IgG分子与二氢卟吩e6（Ce6）的天然结合特性，制备IgG与Ce6结合的纳米复合物Chloringlobulin，平均粒径为~30 nm，其在血清中12 h出现聚集峰。而不结合抗体的Ce6对照组在血清中2 h开始出现聚集。表明相比于对照组，Chloringlobulin在血清中的稳定性更强。但是Chloringlobulin在血清中的这种稳定性存在一个时间窗。Chloringlobulin在10% 胎牛血清（FBS）中2 h之后的释放显著高于其在PBS中的释放，说明Ce6被FBS中的其它血清成份竞争结合，加速释放。分别与对照组纳米粒相比较，cRGD-PaNPs在静脉给药后12 h显示肿瘤富集特性，而Chloringlobulin在静脉给药后1 h即显示肿瘤富集特性。与cRGD-PaNPs相比较，Chloringlobulin中光敏剂分子的血中清除半衰期更短，说明Chloringlobulin可更好地实现对于光敏剂快速起效、快速清除的药动学性质要求。小鼠肿瘤模型评价光动力联合αPD-L1、αCTLA-4双免疫检查点阻断治疗效果显示，两者对肿瘤治疗产生协同治疗效果，且能够有效抑制肿瘤的复发。进一步的机制研究阐明光动力联合αPD-L1、αCTLA-4双免疫检查点阻断治疗协同逆转免疫抑制性的肿瘤微环境，产生获得性抗肿瘤免疫记忆。小鼠评价结果显示，纳米制剂在治疗剂量下具有良好的生物安全性。本项目的研究结果为提高免疫检查点抗体阻断疗法的总体响应率和疗效提供一种新的、有效的思路和方法，并为光动力联合免疫检查点阻断治疗的临床转化奠定实验研究基础。