新型杀虫剂Fluralaner与靶标GABA受体的分子互作机制研究

Fluralaner is a novel marketed insecticide in 2014, which targets GABA receptor (GABAR) with not only efficient and safe features, but also no cross-resistance to the current GABAR-targeted insecticides, and shows an unique interaction mechanism with GABAR. Our project aims to: First, mutate the GABAR subunit RDL of Chilo suppressalis, and detect the differences of electrophysiological effects to explore the pharmacological profiles and binding domains and sites of Fluralaner to heterologous mutant GABAR using voltage clamp technique; Second, establish the mutant strains with mutant RDL subunit by CRISPR/Cas9 technology, and verify the binding sites by detection of the different activity of Fluralaner to mutant strains; Third, establish the interaction model of Fluralaner and GABAR with the homology modeling and molecular docking methods, and elucidate the molecular interaction mechanism between Fluralaner and GABAR in accordance with the difference in molecular pharmacology and the interaction between the interface structure. The completion of the project will reveal novel binding site on GABAR and provide theoretical basis and technical support for development of safe, efficient and new insecticides, which function on the GABA receptor.

Fluralaner是2014年成功上市的一种靶向GABA受体的杀虫剂，不仅高效安全，且与现行GABA受体类杀虫剂无交互抗性，显示出独特的靶标互作机制。本研究拟选用抗药性较重的二化螟为研究对象，首先利用点突变、蛙卵异源表达和电压钳技术测定GABA受体功能亚基不同结构域和重要氨基酸突变对Fluralaner毒理作用的影响，筛选出与分子互作界面形成相关的作用靶点；然后，利用CRISPR/Cas9技术进行基因定点突变，以突变活体试虫验证相关作用靶点；最后，借助同源建模技术和分子对接方法，建立Fluralaner与GABA受体的分子互作模型，以期利用药理学差异与分子互作界面结构的关系阐明两者之间的分子互作机制，从而揭示GABA受体上可能的药物作用新靶点，为安全、高效、新型农药的研发提供理论依据和技术支持。

Fluralaner是2014年上市的一种靶向GABA受体的杀虫剂，不仅高效安全，且与现行GABA受体类杀虫剂无交互抗性，显示出独特的靶标互作机制。本项目首先通过同源建模和分子对接技术，筛选到14个Fluralaner可能与二化螟GABA受体互作的潜在靶点。基于靶点的位置，在体外通过定点突变构建了CsRDL基因的12个突变体。通过双电极电压钳技术测得第三跨膜域第三个氨基酸位点（甘氨酸，G）能够对Fluralaner与重组的二化螟及其他昆虫GABA受体的互作产生决定性的影响。然后，利用CRISPR/Cas9技术进行基因定点突变，构建了靶点突变(G3M, G3Q)的试虫突变品系。生测结果表明，G氨基酸的突变杂合体并未表现出抗性，但其纯合体的幼虫可以对Fluralaner产生>1000倍的抗性，因此可以明确，RDL第三亚基的第三跨膜域G氨基酸是Fluralaner与昆虫GABA受体结合的关键位点。最后，我们利用同源建模和分子对接技术，建立了小鼠和昆虫（果蝇和二化螟）GABA受体与Fluralaner的结合模型，比较性地解析了Fluralaner与GABA受体的互作机制，为同类型杀虫剂的研发和以该类型杀虫剂为前导杀虫剂的深入开发提供了理论依据。项目执行期内，累计发表科研论文16篇，其中SCI论文13篇。授权和申请专利各1项。培养研究生9名。