Twist/EGFR/DNA-PK,分割照射下宫颈癌获得性放射拮抗的新机制？

局部复发是中晚期宫颈癌放射治疗失败的主要原因。研究表明肿瘤细胞在分次照射下产生放射拮抗。前期我们观察到：射线诱导宫颈癌细胞Twist表达增加；放疗后残余宫颈癌组织Twist、EGFR及磷酸化DNA-PKcs表达较放疗前增加。在此基础上结合他人研究结果，我们提出科学假设：分次照射诱导Twist表达上调，继而通过调控EGFR转录和表达而参与DNA-PK活性调节，使宫颈癌细胞获得放射拮抗。本项目拟利用接受不同照射剂量的宫颈癌细胞株、裸鼠移植瘤模型和患者标本，采用γH2AX焦点检测、实时荧光RT-PCR、RNA干扰、ChIP及EMSA等技术、从分子、细胞及整体水平验证Twist/EGFR信号转导通过参与调节宫颈癌细胞DNA-PK活性使肿瘤细胞产生获得性放射拮抗的理论设想，并探索Twist调控EGFR转录及表达的可能分子机制，为Twist信号通路作为宫颈癌放疗增敏的备选靶点提供理论基础和实验依据。

宫颈癌是严重威胁妇女身心健康的恶性肿瘤之一，放射拮抗是宫颈癌患者局部治疗失败的重要原因。前期研究表明HIF-1α过度表达与不同肿瘤组织和细胞的放射拮抗有关，但目前对于乏氧诱导的放射拮抗的具体机制并不清楚。. 本课题通过构建Twist shRNA慢病毒表达载体和Twist基因真核表达载体，获得Twist稳定基因沉默和Twist稳定表达的细胞系，继而采用克隆形成试验检测不同Twist表达水平的SiHa细胞分别在常氧和乏氧状态下的放射敏感性，采用共聚焦显微镜和western blot方法探讨Twist对常氧和乏氧细胞的放射敏感性的调控是否涉及到抑制EGFR入核，继而影响DNA-PK结合，影响DNA双链断裂的修复。. 研究发现：（1）乏氧和X线照射均刺激Twist表达上调；（2）常氧和乏氧状态下，与SiHa细胞相比，Twist表达下调的SiHa—siTwist1细胞放射敏感性均明显增加；而Twist表达上调的SiHa—Twist1细胞放射敏感性均明显降低。即Twist表达水平变化可明显调控常氧状态和乏氧状态下SiHa细胞的放射敏感性。（3）采用Western blot和共聚焦显微镜检测发现，与未处理的SiHa细胞相比，照射（5Gy X-ray）或乏氧状态下（CoCl2处理）核内EGFR表达水平增加，而在照射+乏氧状态下（CoCl2+5Gy X-ray照射），核内EGFR表达水平最高。而当Twist表达下调时，与各自不同状态（对照组、CoCl2处理组、5Gy X-ray照射组以及CoCl2+5Gy X-ray照射组）的SiHa细胞（正常Twsit表达）相比，SiHa—siTwist1细胞核内EGFR表达水平明显减低，DNA-PK水平也减低。当Twist表达上调时，与各自不同状态的SiHa细胞相比，SiHa—Twist1细胞核内EGFR表达水平明显增加，DNA-PK水平也增加。该结果提示，Twist表达水平变化对于常氧和乏氧宫颈癌SiHa细胞放射敏感性的影响主要涉及到核内EGFR水平变化，继而影响DNA双链断裂修复。. 本研究提示，乏氧和X线照射均可刺激Twist表达上调，而Twist可通过对核内EGFR水平变化的调控，影响常氧和乏氧状态下宫颈癌细胞的放射敏感性，提示Twist信号通路可作为宫颈癌放疗增敏尤其是逆转乏氧细胞放射拮抗的靶点。