ZNF300抑制白血病细胞增殖的分子机制研究

The mechanism of aberrant DNA methylation in leukemia is not yet fully elucidated, and more sufficient scientific evidences are needed for the clinical application of DNA methylation inhibitors. KRAB zinc finger proteins mediate DNA methylation and heterochromatin of chromosome, which silences the target genes; ZNF300, one of KRAB zinc finger proteins, is significantly down regulated in patients with acute myeloid leukemia. ZNF300 inhibits the proliferation of leukemia cell and mediates the DNA methylation of the target genes. However, there is no report on the mechanism of ZNF300 inhibits the proliferation of leukemia cell and mediates the DNA methylation of the target genes. The research will investigate the affection of ZNF300 on the proliferation and differentiation of the primary leukemic cells, apply the ChIP-Seq, microarray, methylation chip, co-immunoprecipitation techniques to analyze the target genes regulated by ZNF300 and the molecular mechanisms of DNA methylation mediated by ZNF300, and use a mouse model as well as primary leukemia cells to explore the relationship between the sensitivity of DNA methylation inhibitor and the expression of ZNF300. This study will reveal the molecular mechanisms of aberrant DNA methylation in leukemia cells, providing new ideas and new targets for prevention and treatment of leukemia.

白血病细胞异常DNA甲基化的机制尚未得到充分阐释，DNA甲基化抑制剂的临床应用尚需更充分的科学依据。KRAB锌指蛋白介导DNA甲基化和染色体异染色质化而沉默靶基因；其中ZNF300在急性髓系白血病中显著下调。ZNF300抑制白血病细胞增殖，介导靶标基因位点的DNA甲基化，但尚无相关机制研究报道。本项目将首先探讨ZNF300 对原代白血病细胞增殖分化的影响。其次，应用ChIP-Seq、基因芯片、甲基化芯片、免疫共沉淀等技术，分析ZNF300调控靶基因、介导DNA甲基化的分子机制。最后，我们将利用原代白血病细胞及小鼠模型探讨DNA甲基化抑制剂治疗效果与ZNF300表达的关系。本研究将揭示白血病细胞DNA甲基化异常的分子机制，为白血病的防治提供新思路和新靶点。

ZNF300基因是从人早期胚胎基因文库中筛选出来的一种典型的KRAB/C2H2型锌指蛋白基因，其异常表达与白血病的发生发展密切相关。但迄今为止，ZNF300基因影响白血病细胞系增殖的分子机制尚未明确。在本项目中我们利用细胞生物学、荧光PCR、流式细胞分析、甲基化芯片、免疫共沉淀-质谱分析、染色质免疫共沉淀-高通量测序等技术手段深入研究了ZNF300基因在白血病细胞增殖和分化中的功能和分子机制。在本研究中课题组发现，1）ZNF300在白血病样本中表达显著下调。2）正常人CD34+细胞向巨核细胞定向分化的过程中ZNF300的表达水平逐渐升高。3）ZNF300可抑制白血病细胞增殖，并促进其分化水平。4）通过甲基化芯片测序提示ZNF300 启动子区域受到甲基化影响，进一步通过CHIP-qPCR及荧光素酶报告基因实验发现ZNF300可以直接结合ZNF300锌指蛋白CDS区，并影响其promoter甲基化水平。5）甲基化抑制剂5-Aza-CdR能提高ZNF300的表达，且甲基化抑制剂浓度越高，ZNF300基因表达水平越高，髓系白血病细胞生长越慢。提示DNA甲基化抑制剂可通过影响ZNF300基因的表达水平间接调控白血病细胞增殖。本研究初步确定了ZNF300基因在白血病发生中的作用，即ZNF300可通过诱导DNA甲基化，进而影响白血病细胞的增殖与分化。本研究初步探讨了ZNF300基因在AML增殖及分化过程的作用，此外本项目初次报道了ZNF300可以介导DNA甲基化调节自身表达水平，揭示了一条新的负反馈调节通路。并为DNA甲基化抑制剂治疗白血病提供了新的分子理论基础。