miRNA在KCNJ5突变与非突变醛固酮瘤中的功能研究

Aldosterone-producing adenoma (APA) is a major type of primary aldosteronism. KCNJ5 mutation has recently been suggested to be critical advances in the pathogenesis of APA. However, the role of miRNA in the development of APA was rarely reported. We previously discovered that the Chinese APA patients had unique KCNJ5 mutation characteristics by sequencing APA tissue from 114 Chinese patients. Based on the previous results, we next prepare to compare and analysis the differentially expressed miRNAs between KCNJ5 mutated APAs（10 cases）, non-mutated APAs（10 cases） and normal adrenal glands（10 cases）and to identify target miRNAs. Next we investigated the role of target miRNAs in the proliferation, apoptosis, aldosterone production and gene expression of H295R cells. Furthermore, we will use RT-PCR to detect the expression of target miRNAs in the preoperative blood samples to compared its expression between the KCNJ5 mutated and non-mutated APA patients, which may help predict the status of KCNJ5 mutation preoperatively and the postoperative prognosis.

醛固酮瘤（APA）是原发性醛固酮增多症主要亚型之一。KCNJ5基因突变是APA发生机制的重要研究进展，而miRNA在APA发生过程中的研究至今较少报道。课题组前期在114例APA中对KCNJ5基因进行测序分析发现中国人群中KCNJ5突变有不同于国外的独特特点。基于以上发现，本课题组拟针对KCNJ5突变和非突变的APA与正常肾上腺组织进行miRNA对比分析（肿瘤组各10例，正常肾上腺组10例），根据文献报道和验证结果选择差异明显的miRNA，对该miRNA及其靶基因在肾上腺腺瘤H295R细胞增殖、凋亡、醛固酮分泌及相关基因的表达进行功能学研究；使用RT-PCR检测血标本中组织中差异表达的miRNA的相对表达量，比较血标本中突变与非突变两组中miRNA表达是否存在差异，寻找可能预测是否发生突变的APA，以更好的指导对APA患者术后的预后判断。

本项目主要研究内容为miRNA在肾上腺醛固酮瘤中的表达和功能。KCNJ5突变为醛固酮瘤中目前发现的最重要突变。前期针对114例醛固酮瘤组织进行测序发现我国患者该基因突变率高（75.4%），并通过基因芯片分析出GSTA1（谷胱甘肽S转移酶1）基因为调控醛固酮分泌的关键基因。本课题组首先针对GSTA1基因表达和功能机制进行研究，发现GSTA1在醛固酮瘤中表达较正常组织低，并且在高醛固酮分泌KCNJ5突变组织中表达更低，功能试验显示过表达GSTA1可以降低醛固酮分泌，进一步机制试验显示，GSTA1可通过细胞内Nox酶-活性氧-过氧化氢信号通路调节醛固酮的分泌。课题组进一步筛选醛固酮瘤和正常肾上腺、KCNJ5突变与非突变组织之间的差异miRNA，我们在醛固酮瘤和正常肾上腺之间筛选出50个表达上调的miRNA和43个表达下调的miRNA，但在KCNJ5突变与非突变组织之间未检出有显著差异，这与mRNA芯片结果相一致。进一步我们使用miRSystem网站通过筛选靶向作用于GSTA1的miRNA，并与第一种方法筛选出miRNA做交集，选择miRNA92a作为研究对象。实时定量PCR试验显示miRNA92a在APA组织中的表达较正常肾上腺组织升高2.15倍，加入miRNA92a mimics及inhibitor后可分别升高和降低CYP11B2基因表达和醛固酮分泌。后续表达及功能试验显示miRNA92a表达与GSTA1呈显著负相关，双荧光素酶报告基因试验示miRNA92a可与GSTA1 3‘UTR直接结合。总之，本项目在前期检测醛固酮瘤KCNJ5突变基础之上，发现GSTA1基因为调控醛固酮分泌的关键基因，进一步筛选发现miRNA92a可上游调节GSTA1表达，进而调控醛固酮分泌，建立miRNA92a-GSTA1-细胞内氧化应激信号通路-CYP11B2为调控醛固酮分泌的新途径，为后续肾上腺醛固酮瘤发病机制研究及药物研发提供新的理论依据。