基于S100A9的针刺抗哮喘p38MAPK信号通路磷酸化作用研究

本项目建立在我们针刺治疗哮喘临床有效，并经多年针刺抗哮喘效应机制研究有所发现的基础之上。我们前期基因组研究证明，针刺抗哮喘能调控S100A9钙结合蛋白和MAPK信号通路多个基因的差异表达。预初研究提示S100A9表达定位在哮喘大鼠气管平滑肌细胞；小样本体内、外功能实验初步表明S100A9重组蛋白具有一定剂量范围内的体内降低哮喘大鼠气道阻力和体外舒张大鼠气管螺旋条平滑肌作用。在上述工作基础上，本项目拟深入研究针刺抗哮喘差异表达重组蛋白S100A9体内、外功能，从气管平滑肌细胞内、外两个层面，进一步研究S100A9对p38MAPK信号通路下游因子不同时间点基因、蛋白表达和磷酸化动态改变，以期明确S100A9抗哮喘功能及其对p38MAPK信号通路磷酸化作用在针刺抗哮喘过程中的意义，为针刺抗哮喘效应机制研究提供新的科学依据和理论解释。

本项目通过克隆重组方法构建大鼠S100A9基因原核表达质粒，利用亲和层析蛋白纯化法共获得可溶性S100A9蛋白16.5mg。体内实验发现0.1μg/kg和10.0μg/kg S100A9蛋白可显著降低哮喘大鼠气道阻力(P<0.05)，且效应和相同浓度对照蛋白硫氧还蛋白(Trx)对比有明显区别(P<0.05)，提示S100A9降低大鼠气道阻力效应具有一定蛋白特异性；量效研究发现不同剂量S100A9蛋白均可显著降低哮喘模型气道阻力(P<0.05)，各组相比有明显统计学意义(P<0.01)，提示S100A9对哮喘模型气道阻力作用呈现一定剂量依赖关系。大鼠离体气管螺旋条张力实验发现100、200、400和800 ng/ml S100A9蛋白可显著降低大鼠离体气管螺旋条张力(P<0.05)，和同浓度对照蛋白Trx相比有明显差别(P<0.05)，提示S100A9降低大鼠离体气管螺旋条张力效应具有一定蛋白特异性；不同剂量S100A9蛋白均可显著降低离体气管螺旋条总张力(P<0.05)，提示S100A9对大鼠离体气管螺旋条舒张作用呈现一定剂量依赖关系。细胞学实验发现50-800ng/ml S100A9蛋白可抑制气管平滑肌细胞在24h、48h和72h增殖效应；800ng/ml S100A9具有抑制气管平滑肌细胞迁移和舒张平滑肌细胞作用。机制研究发现胞外添加800ng/ml S100A9蛋白可磷酸化p38MAPK蛋白，其中5-30min磷酸化程度最高，NF-κB通路IKKα和p65蛋白表达也受到S100A9影响，提示S100A9磷酸化p38MAPK并调节NF-κB通路相关蛋白可能是舒张气管平滑肌细胞作用机制之一。在上述工作基础上，利用慢病毒载体构建并分别获得S100A9基因表达增高56倍和降低10倍的大鼠气管平滑肌稳转细胞株，功能学实验发现S100A9高表达状态可显著抑制PDGF诱导的细胞增殖效应，而S100A9蛋白低表达可显著增加气管平滑肌细胞增殖效应；Western blot检测发现S100A9高、低表达平滑肌细胞出现对p38MAPK和NF-κB通路蛋白表达的相反调节，提示S100A9作用可能和上述通路密切相关。