基于kdr负交互抗性的植物源杀虫化合物haedoxan A作用位点的研究

Previous studies found that botanical insecticidal compound haedoxan A(HA) has significantly negative cross resistance to knock down resistance (kdr) insects. Although HA acted on the insect voltage gating sodium channels and caused to inactivation voltage shifted to hyperpolarizing direction, the mode of action of HA is different from those of other sodium channels neurotoxins including pyrethroids and sodium channel block insecticides (SCBIs). Our hypothesis is that HA acts on a unique binding site in sodium channels, which is allosterically coupled with pyrethroid binding site. Therefore, using site-directed mutagenesis and two electrode voltage clamp recording technique based on Xenopus oocyte of heterologous expression of mutant channels in cockroach BgNaV1-1a sodium channel, combining with homology modeling and molecular docking, and functional verification of the predicted target sites, this program intends to identify the binding site of HA acting on BgNaV1-1a, to elucidate the action mode of HA. Elucidation of the mode of action of HA and identification of the HA receptor sites would provide a structural background for the rational design of new and more potent insecticides.

前期研究发现植物源杀虫化合物haedoxan A(HA)对击倒抗性(kdr)昆虫具负交互抗性。虽然HA作用于昆虫钠通道，引起失活电压向超极化方向显著移动，但其作用机理明显不同于已知的昆虫钠通道神经毒剂（包括拟除虫菊酯类和钠通道阻断杀虫剂），因而推测 HA 在钠通道上有一个独特的与拟除虫菊酯类结合位点别构偶联的结合位点。本研究拟应用分子定点突变技术与爪蟾卵母细胞异源表达的双电极电压钳技术，结合同源建模和分子对接，预测 HA 在蟑螂钠通道BgNaV1-1a上的作用位点，并通过点突变对这一新的结合位点进行功能验证，阐明 HA 的作用机理，为开发作用于昆虫钠通道特异位点的新型杀虫剂奠定基础。

本项目旨在明确透骨草中高杀虫活性成分双氧木脂素A（HA）作用昆虫钠通道的靶标结合位点并阐明其杀虫机制，为作用昆虫钠通道新型靶标位点的杀虫剂生物合理设计和害虫抗药性治理策略提供依据。.通过系统的生物测定，证实果蝇、家蝇和埃及伊蚊等不同昆虫的抗拟除虫菊酯类杀虫剂品系对HA具有负交互抗性或没有明显交互抗性；对埃及伊蚊隔代抗性选育27代，筛选出具有代谢抗性的HAR品系，其抗性适合度低，对常用杀虫剂无明显交互抗性，抗性风险评估表明HA在田间不易产生抗药性。采用定点突变、分子对接和双电极电压钳记录技术结合爪蟾卵母细胞异源表达技术，测定分析了HA对果蝇、德国小蠊及大鼠等钠通道及相关定点突变体通道门控功能的影响，发现HA在昆虫钠通道上具有一个作用新颖的结合位点，该位点与拟除虫菊酯类杀虫剂的结合位点部分重叠或别构偶联，拟除虫菊酯类杀虫剂结合位点氨基酸的突变，可导致HA与昆虫钠通道结合位点亲和性增强，引起负交互抗性；同时，发现高浓度HA对哺乳动物钠通道的功能没有明显的影响，结合细胞毒性测定，分析表明HA对高等动物低毒安全。另外，采用细胞内微电极记录技术研究了HA对不同神经遗传背景的果蝇神经—肌肉接点突触及感觉—中枢—运动神经回路兴奋性传递的影响，从神经突触功能角度不仅进一步证实HA作用昆虫钠通道，还发现HA作用昆虫二价阳离子通道DSC1。最后，转录组分析及RNA干扰还表明HA可能作用昆虫神经突触的烟碱型乙酰胆碱受体等配体门控通道，影响突触兴奋性传递,导致昆虫神经性中毒。.本项目从分子水平首次揭示了HA作用昆虫钠通道上新颖的靶标作用位点，建立和优化了HA与钠通道蛋白结合的3D模型，具有原创性。.本项目发表SCI收录论文10篇，国内刊物1篇；获得国家发明专利1件；毕业博士1名，硕士7名。