ATM磷酸化PKM2在神经胶质瘤DNA损伤同源重组修复中的机制研究

Glioma is the most common primary central nervous system tumor. The main therapeutic way for glioma is surgery, radiotherapy and chemotherapy. After radiotherapy, which leads to the DNA damage by ionizing radiation (IR), tumor cells will apoptosis. Our preliminary data indicated that after IR, ATM could bind with the nuclear translocated PKM2 and therefore may phosphorylate PKM2. In addition, the glioma cells transfected with PKM2 shRNA lentivirus showed decreased homologous recombination (HR) events. However, whether ATM could phosphorylate PKM2 remains to be further proved. Besides, the exact amino acid site of PKM2, which is phosphorylated by ATM, need to be uncovered. Furthermore, whether phosphorylated PKM2 by ATM is involved in HR is still unclear. Therefore, based on these unresolved questions, we hypothesized that ATM phosphorylates PKM2, and thereby promotes the DNA HR repair. To validate our hypothesis, we will perform in vitro and in vivo phosphorylation study on whether ATM phosphorylates PKM2, and further explore the phosphorylation site of PKM2. Meanwhile, we will investigate the molecular mechanism of DNA HR repair induced by ATM and PKM2, and clarify the cell survival mechanism after IR by phosphorylated PKM2. This study is of critical importance by providing new scientific evidence for the glioma therapy.

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，其主要治疗手段是手术及放化疗，而放疗主要是通过电离辐射（IR）造成DNA损伤进而诱导肿瘤细胞凋亡。我们的前期研究结果表明，IR后胶质瘤细胞核内的ATM可与核内转移的PKM2结合并可能磷酸化PKM2，此外PKM2基因沉默的胶质瘤细胞其同源重组修复率明显降低。但ATM是否磷酸化PKM2尚有待进一步证实，并且PKM2被磷酸化的位点以及磷酸化的PKM2是否参与DNA损伤同源重组修复尚有待明确。因此申请人提出假说，在胶质瘤细胞中，ATM通过磷酸化PKM2，促进损伤的DNA进行同源重组修复。基于这一假说，申请人将采用体内、体外磷酸化实验研究ATM是否磷酸化PKM2以及PKM2被磷酸化位点，同时研究ATM和PKM2在胶质瘤细胞DNA损伤后同源重组修复的分子机理，明确二者在放疗后诱导胶质瘤细胞存活的机制，为以ATM为靶点的胶质瘤治疗提供新的科学依据。

胶质瘤是严重危害人类健康的中枢神经系统肿瘤，具有治愈率低、复发率高、病死率高的特点，且由于其早期就已呈现浸润性生长导致手术难以切除，因此胶质瘤的放疗治疗尤为重要。但由于肿瘤细胞存在针对放疗所致DNA损伤的修复系统，因此放疗后肿瘤复发率极高，而本研究主要聚焦于放疗所致DNA损伤后的同源重组修复（HR）。我们首先通过免疫荧光染色和免疫印迹方法，观察到电离辐射后肿瘤代谢关键蛋白PKM2由细胞浆进入到细胞核，接着通过免疫共沉淀寻找到HR修复信号通路关键蛋白ATM与PKM2结合。然后，通过体外磷酸化实验、体内磷酸化实验明确ATM磷酸化PKM2。紧接着，我们构建了6中不同氨基酸片段的PKM2质粒，通过表达纯化以及体外磷酸化实验寻找到PKM2被磷酸化的片段（303-389）。然后，点突变该区域中的T327A，通过比较野生型和T327A PKM2与ATM的免疫共沉淀差异和PKM2的磷酸化差异，寻找到327为的苏氨酸为ATM磷酸化PKM2的位点。最后，对ATM磷酸化激活PKM2这一信号通路进行生物学功能验证。通过流式细胞术检测到PKM2敲低的细胞HR修复显著降低(P<0.05)，而过表达PKM2的细胞HR修复增加(P<0.01)。同时，转入T327A突变的PKM2的细胞，HR修复显著降低（P<0.01）。此外，荷瘤鼠动物实验也表明，抑制ATM/PKM2信号通路能显著降低肿瘤体积（P<0.01）和肿瘤重量（P<0.01），减少放疗后DNA损伤HR修复（P<0.01）并延长荷瘤鼠寿命（P<0.05）。综上，放疗辐射后，PKM2由细胞浆进入到细胞核，然后ATM磷酸化PKM2的327位的苏氨酸进而激活PKM2，使得入核的PKM2参与到放疗后HR修复这一生物学功能中。抑制ATM/PKM2信号通路能通过阻断放疗后HR修复，从而提高放疗敏感性、促进肿瘤凋亡。本课题提出新的放疗后DNA损伤HR修复信号通路。本课题的完成，拓展我们对放疗后DNA损伤HR修复的认识，为肿瘤放疗治疗提供新的思维和治疗策略，也为肿瘤放疗靶向治疗提供重要科学依据。