H2A-Perforin融合蛋白对小鼠肝移植后免疫反应性的影响及机制

诱导受者对同种异体移植物的免疫耐受或特异性低免疫反应性从而实现免用或减少广谱免疫抑制剂的应用是未来进一步提高受者长期生存率的主要有效手段。供体主要组织相容性复合物（MHC）与受者T细胞结合的分子限制性，决定着移植免疫应答的特异性。本研究根据T细胞受体（TCR）与MHC分子结合的"高密度配体模型"理论，构建、纯化小鼠非多态性MHC II类分子（H2A）的α1链中TCR结合位点恒定段与穿孔素（Perforin，PFN）的融合蛋白，利用MHC分子在供体特异的T细胞克隆识别、锚定的靶向作用及PFN的细胞裂解作用，杀伤供体特异性T细胞克隆，通过单向混合淋巴细胞反应、同种异体小鼠原位肝移植的在体实验，探讨H2A-perforin融合蛋白对大鼠肝移植后免疫反应性的影响及作用机制，为降低供体特异的免疫反应、设计抗移植排斥的新药物提供理论依据。

本课题“H2A-Perforin融合蛋白对小鼠肝移植后免疫反应性的影响及机制”原计划以穿孔素对T细胞的非特异性杀伤来达到预基因目的，基金开题论证过程中，相关专家建议采用生物学作用较为明确的CTLA4-IgG来取代穿孔素进行相关研究，最终的研究结果及目的并不与课题原始目标相违背。. 课题首先通过分子生物学手段，克隆了CTLA4、IgG2a以及在抗原决定簇H2Aa分子并经测序证实克隆的正确性。继而将上述分子亚克隆至原核表达载体形成H2Aa-CTLA4-IgG2a表达载体，并构建了H2Aa-100，H2Aa-200截短型表达载体，以筛选对免疫抑制最为有效的区域。将上述表达载体导入原核表达菌BL21中，施以ITPG成功诱导出了上述不同载体的原核表达蛋白，并利用HIS标签进行亲和纯化，成功获得系列目的蛋白。采用单向混合淋巴细胞反应的方法及3H胸腺嘧啶（3H-TdR）掺入法，以BALB/c小鼠T细胞为刺激细胞，昆明小鼠T细胞作为反应细胞，将纯化的H2Aa-CTLA4-IgG2A系列融合蛋白按不同浓度比例（0.1、0.5、1.0mmol三组）加入MLR体系，以不加融合蛋白为对照组，检测每组cpm值。数据显示，各组融合蛋白能明显抑制混合淋巴细胞反应，随着融合蛋白使用浓度的增强，对混合淋巴细胞反应的抑制作用越强，数据同时显示H2A全长融合蛋白对混合淋巴细胞反应的抑制作用最强。课题研究继而在动物水平进行观察，对肝脏移植手术组动物给予相应融合蛋白尾静脉注 射（2mg/30g体重，于术后即刻，1，3，5，7d共注射治疗5次），初步数据显示，H2Aa-CTLA4-IgG2A融合蛋白能显著延长移植物存活时间，单纯对照组动物存活时间为8d左右，CTLA4-IgG2A对照治疗组为12d左右，而实验治疗组则为22d左右，数据差异显著。对术后5天外周血抑制性T细胞水平检测数据显示，实验治疗组能使Treg细胞水平显著增高至60%左右（单纯手术组14%左右，对照治疗组30%左右），显示H2Aa-CTLA4-IgG2A融合蛋白对移植动物具有较好的免疫抑制作用。