长牡蛎肽聚糖识别蛋白及其介导的免疫应答机制研究

Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) are a class of pattern recognition receptor proteins，which can recognize peptidoglycan and bacteria containing peptidoglycan specifically, and play an important role in the recognition and regulation of the innate immune response. In the present project, Crassostrea gigas is selected as the research object, and the techniques in bioinformatics, molecular biology and immunology will be used to (1) clone the full-length cDNA of S-type and L-type PGRPs, and analyze their phylogenetic relationship; (2) investigate the expression pattern of these PGRPs after oyster are stimulated by pathogen-associated molecular patterns; (3) recombine these PGRPs and compare their immune functions to investigate the division of labor and collaboration in the immune response; (4) mutate the key amino acids of the PGRPs and clarify their relationship with immunological activity; (5) investigate the change pattern of related gene expression and immunological indexes in the signaling pathway and determine the possible immune activation pathway mediated by PGRPs; (6) silence the expression of these genes and reveal their roles in immune defense against pathogens. The project will provide evidence for further revealing the evolution relationship of PGRPs, and provide useful evidence for understanding the function, division of labor and mechanism of molluscan PGRPs, and shed new insight and theory into marine invertebrate immunology.

肽聚糖识别蛋白（PGRPs）是一类能特异性识别肽聚糖和含肽聚糖细菌的模式识别受体蛋白，在固有免疫应答中发挥重要作用。本项目以长牡蛎为研究对象，拟采用生物信息学、分子生物学和免疫学技术，克隆长短型 PGRPs 基因，确定其系统进化关系；在个体水平研究这些基因在病原相关分子模式刺激下的表达特征；体外重组各类 PGRPs，比较它们的免疫学活性差异，探讨其在整个免疫应答中的分工与协作关系；定点突变特定氨基酸，阐明它们与某种免疫学活性间的关系；检测相关信号通路中的基因表达及免疫学指标的变化，确定长牡蛎中由PGRPs介导的免疫应答途径；沉默 PGRPs 在体内的表达，明确其在长牡蛎抵御病原微生物侵袭中的作用。该项目将为进一步揭示 PGRPs 的进化脉络提供证据，为系统深入了解软体动物各类 PGRPs 的功能、分工和作用机制提供有力依据，并为丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供新的思路和理论支持。

项目负责人按照课题合同中的研究内容开展相应研究工作，已基本完成任务书制定的预期目标。具体研究结果如下：克隆获得8种长牡蛎PGRP的cDNA序列并完成对应蛋白的原核体外重组表达工作；查明8种PGRP的mRNA遍布各个组织，根据其组织特异性可分为四类；根据不同发育阶段的转录组数据，9种PGRP的发育图谱可分为五大类；PAMP刺激能显著诱导CgPGRPS1，CgPGRPS2，CgPGRPS7和CgPGRPL1表达，且其表达模式不同；细菌和高温胁迫会显著抑制长牡蛎单轮幼虫和D型幼虫的钙质壳的形成并造成幼虫的大量死亡，有5种PGRP（CgPGRPS1，CgPGRPS4，CgPGRPS5，CgPGRPS6和CgPGRPL1）仅受热刺激调控，而CgPGRPS3既受热调控又受细菌调控；根据结构特点、进化分析、组织分布、发育模式以及刺激表达模式，选取CgPGRPS1、CgPGRPS2、CgPGRPS4、CgPGRPS7和CgPGRPL1进行了下一步的功能研究，制备了这5种蛋白的多克隆抗体；亚细胞定位分析表明CgPGRPS1、CgPGRPS2、CgPGRPS4和CgPGRPL1主要定位于细胞质，而CgPGRPS7主要定位于细胞核，同时也在细胞质中呈点状分布；CgPGRPS1、CgPGRPS2、CgPGRPS7和CgPGRPL1在蛋白水平上的组织分布结果与mRNA水平上的组织分布一致；序列和进化地位相似、表达模式不同的CgPGRPS2和CgPGRPS4表现出不同的PAMP结合和菌结合活性，推测它们可以通过不同途径参与长牡蛎免疫应答过程；而长型PGRPs的不同亚型CgPGRPL1L和CgPGRPL1S表现出类似的PAMP结合活性、菌结合活性和凝菌活性；菌刺激仅能显著降低牡蛎幼体内超氧化物歧化酶（SOD）活性，而热刺激能显著降低牡蛎幼体内SOD活性和总蛋白提取物中酚氧化酶（PO）的活性。. 本项目利用分子生物学、免疫学和生物信息学相关技术查明了长牡蛎各类PGRPs的基因结构与进化关系，揭示了PGRP基因在细胞和组织水平的分布、发育与诱导表达模式，验证了重组PGRP蛋白的免疫学活性，推测了它们可能参与的免疫应答途径。研究结果表明长牡蛎各类PGRPs在整个免疫应答中发生功能分化，为深入了解长牡蛎PGRPs的功能、分工和作用机制提供了有力依据。