PQQ抗氧化调节机制及调节T6SS分泌的机制研究

Pyrroloquinoline-quinine (PQQ) is an aromatic tricyclic o-quinone and serves as the third cofactor of a number of redox enzymes. It plays multiple important roles in growth, energy metabolism and stress response including oxidative tolerance of living things. However, little is known about the anti-oxidative mechanism in the bacteria. Serratia sp. FS14 is a potential plant growth promoting bacterium. Our studies showed that the PQQ deficient cells showed much less hydrogen peroxide tolerance compared with wild-type cells. More interestingly, the PQQ deficiency also affects the secretion of the Type VI Secretion System (T6SS). As recently studies showed that T6SS is critical for bacterial survival under oxidative stress, our study will not only study the anti-oxidative mechanism of the PQQ in FS14, but also focus on the regulation mechanism of PQQ on the T6SS secretion and possible relationships between PQQ and T6SS in the anti-oxidative regulation, by studying that if the PQQ regulates the T6SS through various anti-oxidative regulator and/or other anti-oxidative proteins, or by activating the Ser/Thr kinase PpkA in the T6SS. This study would expand our knowledge about the functions of the PQQ and T6SS, and provide the basis for the future applications of PQQ in medicine and T6SS as a drug design target.

吡咯喹啉醌（PQQ）是一种芳香三环邻醌，是生物体内氧化还原类酶的第三种辅酶，在生物的物质与能量代谢以及抗氧化等抗逆境中起着极其重要的作用，但目前对细菌中PQQ参与防病抗逆的作用机制却知之甚少。沙雷氏菌FS14是一株具有生防潜能的细菌，初步研究结果显示：PQQ合成缺失后，突变株的抗氧化能力大大下降；且PQQ的缺失还影响了该菌六型分泌系统（T6SS）的分泌作用。由于T6SS在细菌的竞争及抗氧压等逆境中起重要作用，因此，本项目拟在研究FS14中PQQ抗氧化作用机制的基础上，将研究PQQ是否及如何通过激活各类氧压调节蛋白及其它抗氧化相关蛋白，或是否通过PpkA等蛋白激酶来调控T6SS的分泌，从而明晰PQQ调节T6SS分泌作用的具体机制及两者在抗氧化调节中的作用与关系。本研究不仅能更深入地诠释PQQ的生物学功能，而且将会对PQQ在医学领域及利用T6SS作为药物的靶标等应用奠定坚实的理论基础。

本项目主要对沙雷氏菌FS14的抗氧化机制、PQQ在FS14抗氧化过程中作用及作用机制以及PQQ调控六型分泌系统（T6SS）分泌的机制进行了深入研究；还对PQQ在细菌体内可能的其它生理功能进行了一些探索研究。研究发现，FS14中有多种转录调节蛋白（包括双组份调节系统及抗氧化调节蛋白）、可替代sigma因子及抗氧化酶类参与了FS14的抗氧化作用；其中PQQ可通过激活过氧化氢酶的表达和活性从而提升FS14的抗氧化能力，但是PQQ不能激活过氧化物歧化酶的转录；PQQ的缺失会导致抗氧化调节蛋白03795及与抗逆相关sigma因子RpoS转录水平的提高，进而进一步调节细菌的抗氧化能力；在PQQ调节T6SS分泌的机制研究中，发现PQQ可以通过影响葡萄糖脱氢酶的活性进而改变培养基pH，从而调节T6SS的分泌；与已报道结果不同的是，在FS14中，低pH并不能提高六型分泌系统的表达；本项目还对野生型和PQQ缺失突变株的转录组进行了测定，对测定结果中显示转录水平有较大差异的蛋白或与抗氧化等抗逆相关的蛋白，将它们基因的启动子分别融合LacZ基因后进行β-半乳糖苷酶活性的测定，结果显示大多数转录组测定中有转录差异的基因在相对应的β-半乳糖苷酶活性的测定中并无明显差异；在研究FS14抗氧化的过程中，还发现一些调节抗氧化的双组分系统及调节蛋白对灵菌红素的合成也有影响。由于灵菌红素在体外研究中显示其与抗氧化有关系，我们也对这些调节蛋白对灵菌红素的合成的调节进行了研究，明确了在FS14中，灵菌红素的合成是通过RpoS依赖型的RNA聚合酶来完成的，与之前报道的39006中灵菌红素的转录方式不同；双组份系统CpxRA负调控灵菌红素的合成; 03795也可以和灵菌红素基因簇的启动子结合，从而激活灵菌红素的转录，但其调节方式与其调节抗氧化的方式完全不同，具体调节方式及机制正在深入研究中。这些结果为更深入地研究FS14的抗氧化机制及诠释PQQ的生物学功能，为PQQ及灵菌红素将来在医学领域的应用及利用T6SS作为药物的靶标等应用奠定了坚实的理论基础。