经生物信息系统挖掘肝癌相关甲基化生物标记物在大样本人群验证及功能研究

China is one of the countries with high incidence of hepatocellular carcinoma. It is important to identify effective biomarkers for better preventing, diagnosing, and treating hepatocellular carcinoma. Studies have shown that DNA methylation is an effective molecular biomarker. Our previous studies found that simultaneous methylation of cg12614630,cg23371746, cg25340966, cg19786751 and cg06131338 may contribute to diagnosis of hepatocellular carcinoma. Meanwhile, methylation of ACACB promoter may affect the occurrence of hepatocellular carcinoma. Our study is based on an established hepatocellular carcinoma tissue bank. Firstly, we analyzed the combined-diagnostic ability of above five methylation louses by pyrosequencing. Then we observed the effect of methylation of ACACB promoter on gene expression and tumor cell behavior before and after demethylation treatment. Finally we treat cg12614630 whit cas-9 system, and examined the effect of cg12614630 methylation on tumor behavior of hepatocellular carcinoma cells. In summary, the results of this study are expected to find a biomarker for the diagnosis of hepatocellular carcinoma.

我国是肝癌高发国家之一，寻找诊断肝癌的有效生物标记物，对开展肝癌防治工作极为重要。有研究表明，DNA甲基化可作为肿瘤有效的分子生物标记物。因此找到肝癌相关甲基化标记物，对肝癌的早期诊断、预后有重要意义。本项目在前期研究工作基础上，进行系统生物信息学分析发现，cg12614630、cg23371746、cg25340966等5个甲基化位点的联合及ACACB启动子的甲基化对肝癌具有潜在影响作用。但目前相关研究尚缺乏，因此拟首先利用已建立的肝癌组织样本库，通过焦磷酸测序对以上5个甲基化位点进行肝癌联合诊断能力分析。再通过去甲基化前后对比ACACB启动子甲基化对基因表达及肝癌细胞肿瘤行为的影响。最后通过cas-9系统使重要位点cg12614630位点去甲基化，检测其甲基化对肝癌细胞肿瘤行为的影响。本项目研究结果有望找到明确的肝癌联合诊断生物标记物，为肝癌诊断发现新的联合诊断和治疗靶点提供重要参考。

原发性肝癌是全球第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因，严重威胁人类生命健康，而早期确诊仍然是困扰其诊治的难题之一。DNA甲基化作为癌症发生的警示性标记之一，可能通过调控基因表达影响癌症的发生或进展。本研究旨在挖掘肝癌相关甲基化生物标记物，探讨其作用机制。本研究对TCGA数据库的数据进行生物信息学分析筛选出5个候选甲基化CpG位点。收集50例早期HCC临床组织样本进行焦磷酸测序和qRT-PCR检测，结果显示，cg12614630（GPR182）、cg19786751（ACACB）和cg06131338（ACACB）位点的甲基化水平与所在基因的表达量呈负相关，这3个位点联合诊断早期HCC具有良好的诊断效能。另外，cg12614630、cg19786751和cg06131338位点对HCC的联合诊断能力在GSE54503、GSE89852和GSE56588三个不同群体中得到验证。本研究还下载TCGA数据库中13种常见肿瘤的甲基化数据进行候选位点甲基化差异分析，结果显示这3个位点均高甲基化在HCC中具有组织特异性。进一步培养肝癌细胞系检测cg06131338的甲基化水平及ACACB基因的表达量，并进行肝癌细胞系生物学功能验证，结果显示，肝癌细胞系中cg06131338位点甲基化与ACACB基因存在负相关关系，ACACB基因表达可能受cg06131338甲基化异常的调控而影响肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。对cg12614630进行去甲基化实验，结果表明，GPR182基因表达水平随着cg12614630甲基化水平的降低呈增高趋势，然后对cg12614630位点及GPR182基因进行肝癌细胞系生物学功能研究，结果显示，cg12614630高甲基化可能通过抑制GPR182的表达而增强肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，且抑制肝癌细胞凋亡。此外，利用生物信息学对HCC预后相关生物标志物进行数据挖掘的研究显示，F2、GOT2及TRPV1低表达与肝癌不良预后相关，且F2-GOT2-TRPV1组合能较好地预测肝癌预后；ITGB3BP的高表达与肝癌淋巴结转移显著相关。本研究挖掘了HCC早期诊断和预后的生物标记物，揭示了DNA甲基化位点：cg06131338（ACACB）位点和cg12614630（GPR182）位点参与肝癌发生进展可能的生物学机制，为今后肝癌的早期诊断、治疗提供了重要的理论依据。