大豆慢生根瘤菌USDA110高效耐盐基因工程菌株的构建

前期研究显示pha2基因簇编码单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白，对费氏中华根瘤菌RT19 和苜蓿中华根瘤菌042BM的耐盐性起决定作用。因此，本研究拟采取将pha2基因簇转入具有良好的结瘤固氮能力但耐盐性极差的大豆慢生根瘤菌USDA110中，使pha2基因簇在该菌株中高效表达，通过pha2基因簇表达单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白的活性，使USDA110具有转运钠离子等单价阳离子的能力，以提高USDA110的耐盐性，最终达到构建高效耐盐的USDA110基因工程菌株的主要目的。其次，本研究拟采取在遗传研究背景清晰且基因组全序列显示不具有pha2基因簇的USDA110中表达pha2基因簇，通过测试USDA110是否显著提高耐盐性，以达到进一步鉴定pha2基因簇是否对大豆慢生根瘤菌USDA110也具有很好的耐盐作用的目的。

在本研究中，我们首先构建了pha2基因簇的表达载体pVK-pha2。通过三亲本接合，将pVK-pha2和pVK100（负对照）分别转入大豆慢生根瘤菌USDA110，构建工程菌株USDA110/pVK-pha2和USDA110/pVK100。耐盐实验表明，在80 mM NaCl的存在时，前者中的生长情况明显优于后者。进一步使用lacZ报告基因鉴定pha2基因簇在USDA110中成功表达。以上实验表明， pha2基因簇能够在大豆慢生根瘤菌USDA110表达，且能在一定程度上提高其耐盐性。为了进一步提高耐盐工程菌株的耐盐性，我们构建了nhaA表达载体pVKANP(+)并转入USDA110。结果发现，在80 mM NaCl的存在时，USDA110/pVKANP(+)基因工程菌株耐盐能力明显优于USDA110/pVK-pha2。因此，我们构建了基因betS和nhaA的双基因工程菌株。此外，我们也尝试使用强启动子-Trp启动子提高USDA110/ pVKANP(+)中nhaA的表达。结果发现在各种耐盐工程菌株中，USDA110/pVKANP(+)耐盐性最优，其次是USDA110/pVK-pha2。以上研究表明，根瘤菌或大肠杆菌等非耐盐菌中基因的耐盐能力十分有限或者其表达受USDA110调控机制所限，因此无法显著提高其耐盐性。为了克隆高效的耐盐碱基因，我们选择从具有更高效耐盐碱能力的中度嗜盐菌新种中克隆新的或关键的耐盐碱基因，通过这些基因的克隆与功能分析，筛选高效的耐盐碱基因，实现构建USDA110高效耐盐基因工程菌株的目的。最终，我们从中度嗜盐菌新种中克隆得到四个与钠离子输出相关的基因：编码双组分小药物抗性蛋白的基因簇psmrAB、编码新型的NhaD 型钠（锂）/氢逆向转运蛋白基因nhaD、编码由α、β、γ亚基组成的草酰乙酸脱羧酶复合物的基因簇oadGAB和编码依赖Na+的HCT家族转运蛋白的基因sdmlT。我们惊喜地发现sdmlT能够将大肠杆菌（E. coli）的耐盐性从0.8 M NaCl提高到1.5 M NaCl。这表明该基因具有在异源宿主高效表达的能力，应该是一个高效耐盐碱的关键基因。在未来的研究中，我们一方面鉴定其功能，另一方面拟将其导入USDA110，测试其在USDA110中的耐盐性。本研究的开展为我们进一步构建高效耐盐的大豆慢生根瘤菌工程菌株积累了宝贵的经验。