基于蛋白组学的枸杞果实成熟与干制中的多糖累积差异机理研究

The wolfberry polysaccharide is an important index for evaluating the quality of wolfberries. Taking the growth & maturation period and different dehydration processes of the wolfberry as research units, using GC, LC and LC-MS techniques, this study analyzes the accumulation evolution of wolfberry polysaccharides, constructs the monosaccharide constitution, molecular weight distribution, type and structure of wolfberry polysaccharides during the growth & maturation period and different dehydration processes, builds the database of accumulation evolution of polysaccharides during maturation. Using two-dimensional electrophoresis, MS techniques and so on, we study the differential proteomics of wolfberries during the growth & maturation period and different dehydration processes, analyze the differential proteome, and build the database of differential proteome during different stages. By functional identification, analysis and classification of differential proteins, this study identifies the crucial functional proteins (enzymes), and combining the diversity and accumulation changes of wolfberry polysaccharides during the growth & maturation period and different dehydration processes, discusses the effects of crucial functional proteins (enzymes) of wolfberries on the accumulation changes of polysaccharides during the growth & maturation period and different dehydration processes, and then examines and analyzes the related crucial functional proteins (enzymes), and reveals further the molecular principle of evolution of polysaccharide accumulation during different stages. This project will enrich the research contents of evolution of polysaccharide accumulation and provide a theoretical basis for selecting the proper harvest period and proper dehydration technology of wolfberries in production.

枸杞多糖是枸杞品质评价的重要指标之一，本研究拟以枸杞果实生长成熟期与不同干制过程为研究单元；采用气相、液相及液质联用等技术，对枸杞多糖累积演变进行分析，构建枸杞果实生长成熟期与不同干制过程中枸杞多糖单糖构成、分子量分布及类型、结构等，组建枸杞生长成熟过程多糖累积演变数据库；利用双相电泳、串级质谱等技术，开展枸杞果实生长成熟期与不同干制过程中枸杞差异蛋白组学研究，分析差异蛋白组，构建不同阶段差异蛋白组数据库；通过对差异蛋白功能鉴定、分析和归类的研究，鉴定出关键功能蛋白（酶），结合枸杞果实生长成熟期与不同干制过程枸杞多糖多样性及累积变化，探讨枸杞关键功能蛋白（酶）对枸杞多糖生长成熟及不同干制过程积累变化的影响，再对相关的关键功能蛋白(酶)检验分析，进一步揭示枸杞果实在不同阶段中多糖累积演变的分子机理。项目丰富了多糖累积演变的研究内容，为生产上选择合适的枸杞收获期及干制工艺选择提供理论基础。

枸杞为茄科枸杞属药食同源植物，枸杞多糖是枸杞中主要活性成分之一，目前集中于多糖的分离纯化、结构表征和活性验证研究，但对枸杞生长发育和初加工过程中的多糖累积及形成机理研究较少。项目借助蛋白质组学探究枸杞多糖在果实发育和加工过程中的累积变化规律，对揭示多糖在形成机理，进而对枸杞多糖形成，提高多糖利用率具有理论指导意义。研究主要分为三个方面：.（1）枸杞果实的发育生理研究.枸杞果实生长发育分为两次快速生长期和一次缓慢生长期，从坐果到9天，为第一快速生长期，果实为鲜绿色，果实硬度较大细胞壁结构致密，从10天到24天为缓慢生长期，果实粒长粒径变化较小，颜色为翠绿色，果实硬度增大，细胞壁结构致密，从25天到35天为第二个快速生长期，体积，质量变化明显，果实硬度降低，细胞壁结构及细胞间质崩毁。.（2）枸杞多糖在生长发育及干制过程中的结构，理化特性及生物活性变化研究.枸杞多糖含量随果实生长发育逐渐增加，在后期积累明显，且随着枸杞发育枸杞中性多糖减少，酸性多糖增加。分级后得LBP2多糖，主要由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖等6种单糖组成。分子量分布在6-40KDa，红外光谱显示LBP2是一种糖环构象为β-吡喃环形式存在的酸性多糖。电镜观察发现LBP2结构具有明显差异。不同采收期枸杞多糖体外抗氧化活化分析表明，相同浓度下多糖活性为：青果期<转色期<成熟期，相同浓度不同成熟期活性为；头茬果>普通夏果>秋季果。.（3）枸杞多糖在果实生长发育过程中的积累变化机理.应用iTRAQ对5种枸杞果实样品的差异表达蛋白进行测定。共鉴定到差异蛋白1799种，蛋白相对分子质量主要分布在10~70KDa之间。随着枸杞的发育成熟，差异蛋白质数量逐渐增加。生信分析显示，差异蛋白主要以具有催化活性和结合活性的蛋白为主，主要参与细胞的代谢过程。再次筛选与多糖代谢相关蛋白203种，其中与壁多糖代谢直接相关26种，选取10种蛋白进行PRM验证，分析多糖形成机理，构建了多糖合成代谢相关蛋白路径。