Ⅰ型钠离子门控通道基因嵌合突变的鉴定及致痫机理

Ⅰ型电压依赖型钠通道基因（SCN1A）突变是热性惊厥附加性癫痫的遗传因素之一，当突变传递者的突变比例较低即为嵌合突变时，无法有效检测，提高了新生突变的比率，忽略了致病突变遗传的危害性，因此迫切需要有效方法鉴定嵌合突变，开展遗传咨询与检测，降低患病的风险；同时有关突变位点的电生理特征、致痫机理报道甚少。本课题组已在两个GEFS+家系中发现了两个新的嵌合SCN1A错义突变（Q1923R和I1616T），拟构建其真核表达载体，在人胚肾细胞(HEK293)中表达，用膜片钳技术研究电生理特征；并结合患者的临床表现，在细胞水平上研究不同温度和药物对突变钠通道功能的影响，筛选出最佳治疗药物。本项目拟从分子、细胞等不同层次上建立有效的检测嵌合突变的方法，进一步认识钠通道突变导致癫痫发生的机制，建立基因型与临床表型的相关性，为临床诊治、遗传咨询提供依据。

本项目建立了快速、高效检测SCN1A基因嵌合突变技术，能有效检测突变量低至3%的突变，避免了多数携带嵌合突变家系的漏检。该技术结合DHPLC及Pyrosequencing，在14个携带SCN1A突变的癫痫伴热性惊厥附加征家系中，共发现5个嵌合突变，并首次在表型较轻的家系中发现嵌合突变。5个家系中有4个有两个及两个以上后代， 其中3个家系累及两个小孩，提示嵌合突变携带者传递给下一代的几率高，再发风险大，对遗传咨询具有指导意义，提示表型较轻先证者的父母基因检测不能忽视。5个携带嵌合突变家系的先证者中包括2个轻型患者（PEFS+），3个边缘型重症患者（SMEB）。5个突变突变的部位、方式及嵌合突变的量均不同，2个轻型家系中发现的突变为为错义突变，突变部位发生在D4S3区及C末端，嵌合突变量分别为25%及12.5%；3个表型较重的家系中，1个错义突变，发生在在钠离子通道蛋白N端；1个无义突变；1个错义突变，发生在钠离子通道孔区；嵌合突变量分别为25%、40%、40%。突变量的不等，提示在胚胎早期的不同时期，均可以发生突变；当携带变量低于12.5%时，表型正常，存在突变量与表型轻重的一定相关性。为了更好地了解不同突变如何影响钠离子通道的电生理功能，我们构建了5个突变质粒，转染HEK293细胞后，利用膜片钳技术记录钠离子电流，发现孔区突变及无义突变的钠离子通道功能丧失，从而造成钠离子通道阻滞剂类的抗癫痫药物治疗无效，患者表型较重。其它3个突变导致的钠离子通道功能的改变情况仍在研究中。