与细胞壁降解酶基因表达相关香蕉枯萎病菌转录激活因子HFI1的克隆与功能分析

Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 (FOC), the casual agent of banana fusarium wilt, threatens the banana production worldwide. In order to understand the function of cell wall-degrading enzymes (CWDEs) in pathogenesis of FOC and further to provide methods to control the disease, we propose to clone a transcriptional co-activator HFI1 involved in regulation of CWDEs. The proposed study is based on our previous work, which identified T-DNA insrertional mutants with deficency in pathogenicity and CWDEs' activity. Through target gene deletion and complement experiment, gene function of HFI1 will be analysed. Through CWDEs activity detection and related gene expression detection during infection of the banana host, we will reveal the relationship between the target gene HFI1 and CWDEs. Using GFP tagging, we will study the function of the target gene HFI1 related to pathogenic process such as fungal invasion, spread and colonisation in the banana host. In a word, the combination of biochemistry, molecular and cellular methods will lead to a better understanding of the transcriptional co-activator HFI1 in regulation of CWDEs gene expression. Also, the study will provide important evidence on the role of HFI1 in pathogenicity of FOC.

香蕉枯萎病菌4号生理小种是威胁我国乃至世界香蕉生产的重要植物病原真菌。为阐明该病原菌与细胞壁降解酶基因表达相关的致病机理并最终为该病害的防治提供理论依据，本研究拟在前期工作基础上，以筛选的致病力减弱和细胞壁降解酶酶活降低的突变体为材料，对其突变基因转录激活因子HFI1进行克隆；然后，利用基因敲除和互补技术，得到HFI1敲除突变体和互补转化子；通过细胞壁降解酶酶活检测及致病过程中与细胞壁降解酶酶活相关的基因表达水平检测，研究HFI1与细胞壁降解酶基因表达之间的关系；通过致病性测定，利用GFP标记观察HFI1敲除突变体在寄主组织中的侵入、扩展和定殖情况，研究HFI1与香蕉枯萎病菌4号生理小种致病力的关系。最终从生化水平、分子水平和组织细胞水平解析转录激活因子HFI1对香蕉枯萎病菌细胞壁降解酶基因表达的调控机理，以及其在该病原真菌致病过程中的作用。

由尖镰孢菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病是威胁我国乃至世界香蕉生产的重要土传病害，至今仍缺乏高效的防治方法。研究并阐明该病原菌的致病机理对香蕉枯萎病及其他作物枯萎病防治具有重要的指导意义。本研究在前期工作基础上，以筛选的香蕉枯萎病菌致病力减弱和细胞壁降解酶酶活降低的突变体为材料，对其突变的基因HFI1 （编码一种转录激活因子）进行基因克隆和功能研究。应用基因敲除与互补技术，成功获得了4个HFI1基因敲除突变体和2个HFI1互补转化子以及2个已报道细胞壁降解酶调控基因SNF1敲除突变体。以野生型菌株为对照，分别对目标基因敲除突变体和互补转化子进行表型差异分析。结果发现与野生型相比，HFI1敲除突变体生长缓慢，基本丧失了产孢能力；酶活平板检测结果表明HFI1敲除突变体的多聚半乳糖醛酸酶和果胶酸盐裂解酶活性显著降低，而纤维素酶酶活基本没有改变；对细胞壁降解酶（CWDE）合成相关基因表达量的实施荧光PCR检测发现，供试的基因在HFI1敲除突变体中表达均显著地下调，而在其互补转化子中，这些检测的基因又恢复到与野生型菌株相同的表达量；致病力检测结果发现，HFI1敲除突变体的菌丝穿透能力减弱，接种12 d后，仍不能侵入寄主香蕉的根部组织，对香蕉的致病力明显减弱。基因表达量检测发现敲除HFI1明显影响SNF1的正常表达；在FOC全基因组检索发现基因HFI1和SNF1在同一个supercontig上，且HFI1位于SNF1的上游。上述结果表明，香蕉枯萎病菌转录激活因子HFI1除了影响病原菌的生长和产孢外，还可能直接或间接通过调控SNF1基因的表达影响多种细胞壁降解酶的酶活，从而影响病原菌侵入寄主根部皮层组织以及在寄主根部的定殖，并最终影响病原菌的致病力。因此在香蕉枯萎病菌中转录激因子HFI1是一个非常重要的致病因子。