油菜隐性上位互作细胞核雄性不育抑制基因（esp）的克隆与功能分析

隐性上位互作核不育系（9012AB）已经广泛应用于甘蓝型油菜杂交种生产，然而，对其不育及育性恢复的分子机理仍然知之甚少。本项目在完成对隐性不育上位抑制基因esp精细遗传作图的基础上，通过染色体登陆或染色体步行的方法构建物理图谱，并结合单倍型分析、比较表达及软件预测的方法鉴定出esp的候选基因。进而通过互补实验、系统发育进化分析和时空表达分析等手段结合隐性不育基因ms3的研究结果，综合分析该基因在雄配子发育中的功能。该项目的实施，一方面可以克隆到具有自主知识产权的油菜隐性核不育上位抑制基因，探索该基因在油菜隐性核不育雄配子发育异常和育性恢复过程中的分子机理；另一方面可以开发用于esp基因标记辅助选择的PCR标记（包括功能标记），促进该不育系统在油菜杂交种选育过程中的快速利用。

甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB是我国发现、报道并广泛应用于油菜杂交种生产的一种雄性不育类型。该不育系的育性受两对独立遗传的基因控制，分别是BnMs3和BnRf（以前命名为esp）。其中，BnRf位点存在3种复等位基因型，分别命名为BnRfa、BnRfb和BnRfc。在前期将BnRf位点定位在甘蓝型油菜A7染色体上一个新发现的F保守域的上对应拟南芥92kb的物理区段内。在本项目试图采用比较基因组学和图位克隆的方法尝试分离BnRf位点。在采用三个回交群体共计9582个单株的基础上，利用两侧最近的标记将BnRf位点定位在甘蓝型油菜BnRfc基因型材料Tapidor的一个BAC克隆上13.8kb的区段内，预测包括5个候选基因。比较BnRfaRfa和BnRfbRfb基因型的亲本材料发现，G3、G4和G5等3个基因在在编码区不存在多态性。根据重组单株的比较测序则发现G1的多态性与表型无关，表明G1不是BnRf的候选基因。根据BnRfc的序列作为参考，无法分离G2及其侧翼的序列。采用转基因互补分析和反义抑制等手段进一步证明G3、G4和G5不是目标基因的候选基因。因此，目标基因被锁定在G2附近区段。. 为了从变异很大的G2区段分离目标基因的序列，我们利用一份基因型为BnRfa BnRfb的杂合材料构建了新的BAC克隆文库，包含60,000个单克隆。采用BAC质粒混合池的PCR筛选方法，两侧最近标记共鉴定出分别包含BnRfa和BnRfb等位基因的多个BAC克隆。分别挑取代表性的克隆测序后发现，相对于BnRfc中13.8kb的物理区段，BnRfa和BnRfb基因型中分别插入了一个64和74kb的片段，并引发了插入位点附近基因小片段的倒位。通过对该片段的序列差异开发出的标记分析重组单株并结合候选基因分析，最终将BnRf位点定位在8个候选基因之中，其中编号为ORF11的基因极可能是BnRf的目标基因。相关的转基因验证将在2014年春季获得结果。本研究已经基本完成了BnRf位点的克隆工作，为后续的基因功能分析奠定了坚实的基础。