基于单细胞分析技术探讨口蹄疫病毒持续感染机制

The Foot-and-Mouth Disease (FMD), a highly contagious viral disease affecting mammals, has been listed as the top immediately notifiable disease by the World Organization for Animal Health (OIE). The primary cause of FMD outbreak is persistent infection by the Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV). The elucidation of the mechanism of FMDV persistent infection is crucial for the prevention of FMD outbreak. To overcome the limitations of conventional methodologies and provide new insight into the mechanism of FMDV persistent infection, in this proposal, we plan to examine the infection efficiency of FMDV persistent infection and the kinetics of viral genome duplication in individual cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS) and single cell fluorescence quantification RT-PCR, aiming to elucidate the mechanism of enhanced cellular heterogeneity caused by the remarkably uneven distribution of viral load in individual host cells. In addition, we plan to isolate and enrich the easily infected, persistently infected and non-infected cells from the heterogeneous cell population infected by FMDV using single cell purification and culture technique, followed by the FACS analysis of cell-cycle stages and the change of plasma membrane characteristics, to explore the mechanism of enhanced cellular heterogeneity induced by FDMV persistent infection. Furthermore, with the aid of RNA interference and targeted gene knockout, we plan to examine the differential expression of the regulatory factors of host EBP1 and P4HA2f at the single cell level, aiming to understand in more details the regulatory mechanism of these two factors in the establishment or the maintenance of FDMV-sustained infection.

口蹄疫是世界动物卫生组织列为必报动物疫病之首的重大动物传染病。口蹄疫病毒（FMDV）持续感染是口蹄疫爆发的主要原因。因此，解析其持续感染机制对防控口蹄疫爆发至关重要。但由于传统研究技术的局限，迄今对FMDV持续感染机制仍知之甚少。本项目拟采用荧光激活流式单细胞分选和单细胞荧光定量 RT-PCR等新技术，检测FMDV持续感染单细胞的感染效率及基因组复制动力学，揭示其病毒载量在单个宿主细胞中分布极端不均匀而导致细胞异质化程度加重的本质；利用单细胞分离培养技术从FMDV持续感染异质化细胞群体中分离易感染、持续感染和不感染3类同质细胞，分析细胞的周期时相及质膜特性变化，探讨FMDV持续感染加重宿主细胞异质化进程的机制；借助RNA干扰和靶向基因敲除技术，在单细胞水平上研究宿主细胞调控因子EBP1和P4HA2f基因的差异表达与功能，从更精细的尺度上探讨FMDV形成持续感染的调控机制。

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。被世界动物卫生组织列为必报动物疫病之首，我国也将其定为发生时必须依法上报的重大动物传染病。研究表明FMD的爆发虽是FMDV急性感染的结果，但急性感染可转换为持续感染，持续感染在一定条件下又会引发大规模的急性感染，导致FMD的爆发。因此，揭示FMDV持续感染形成和维持的机制，既是消除持续感染隐患的必由之路，也是FMDV持续感染研究亟待解决的重要基础科学问题。.本项目建立了FMDV感染的流式细胞分选技术，通过流式细胞仪内含的FSC、SSC和细胞周期对感染后的细胞及持续感染细胞进行分选，然后通过单细胞荧光定量RT-PCR、流式细胞分析、感染性实验、TCID50测定等技术，对不同异质性组份细胞中FMDV的含量进行了测定，发现在大的细胞、内含物高的细胞及G2/M期的细胞中，病毒的含量明显增多。而后经过吸附实验、流式细胞分析等实验，确定了不同异质性细胞内病毒含量不同，主要是发生在吸附阶段，这种差异是由于细胞表面的受体表达差异而造成的。.本项目还研究了USP11、MXA和EBP等基因在FMDV感染及持续感染中的功能及调控。特别是对EBP基因功能的研究，我们利用单细胞方式，在不同代次的持续感细胞中进行分析，找出了EBP基因与病毒复制的相关性，确定了该基因在病毒复制中的促进作用。此外，还从FMDV持续感染细胞中分离出持续感染脱毒细胞，我们对正常宿主细胞、持续感染细胞及脱毒细胞进行了转录组测序，通过基因的差异表达分析，进一步研究宿主基因在FMDV感染建立、维持过程中的机制，对我们后期进行FMDV持续感染机理的探索及宿主抗病毒机制的分析提供了重要的研究思路。