钙信号转导在三邻甲苯基磷酸酯影响神经细胞自噬中的作用及机制

Tri-ortho-cresyl phosphate (TOCP) is widely used, and the mechanism of its delayed neurotoxicity has not been fully clarified. In recent years, some studies found that autophagy plays an impotant role in the neurotoxicity induced by TOCP, but the regulation mechanism is not clear. Based on our previous studies and founds of TOCP affecting the activities of calpain, PKC and ubiquitin-proteasome, in this project, we will build a delayed- neurotoxicity mode of hens induced by TOCP to observe cell calcium homeostasis, and the dynamic changes of calcium-related signaling molecules, the phosphorylation and ubiquitination of some related cytoskeletal proteins, and the expression of autophagy receptor proteins.Meanwhile, combining with the cell model, we will pinpoint the relationship between the disorder of calcium and change of autophagy induced by TOCP. On this basis, we will also do further research of calpain,PKC, IP3R, calcium signaling related molecules and autophagy receptor protein on the regulating autophagy induced by TOCP by using a series of tool drugs(activators and inhibitors), RNA interference and nerve cell differentiation strategy. The results demonstrate the neurotoxicity mechanism of TOCP,not only broaden the knowledge of delayed neurotoxicity of TOCP, but also contributed to further study the new intervention strategies for neurodegenerative diseases.

三邻甲苯基磷酸酯（TOCP）用途极为广泛，其诱发的迟发性神经毒性机制一直未能完全阐明。近年研究发现“自噬”在TOCP引起的神经毒性中起作用，但其调节机制不清楚。基于我们前期发现TOCP影响calpain、PKC、泛素蛋白酶体活性等工作基础，本项目以TOCP诱发实验鸡迟发性神经毒性模型，观察毒性效应过程中细胞钙紊乱及钙相关信号分子、骨架蛋白磷酸化与泛素化、自噬受体蛋白的动态变化，同时结合细胞模型，明确钙紊乱与TOCP诱发自噬改变的关系。在此基础上，通过应用一系列工具药物（激活剂、抑制剂）、RNA干涉及诱导分化等策略深入研究calpain、PKC和IP3R等钙信号相关分子和自噬受体蛋白在TOCP所致神经细胞自噬中的调节作用与机制。研究结果从新的角度去探索TOCP神经毒性相关机制，不仅有助于拓宽对TOCP诱发的迟发性神经毒性机制的认识，而且对于进一步研究新的干预策略亦有一定的参考价值。

三邻甲苯基磷酸酯（TOCP）用途极为广泛，迟发性神经毒性是其最大的危害之一，但机制一直未能完全阐明。近年研究发现“自噬”在TOCP引起的神经毒性中起作用，但其调节机制不清楚。基于我们前期发现TOCP影响calpain、PKC、泛素蛋白酶体活性等工作基础，本项目研究了细胞内钙紊乱和钙信号转导对 TOCP 诱导神经毒性和影响自噬的作用；TOCP对泛素化降解和溶酶体降解系统的影响和钙信号紊乱的关系；探讨了TOCP 对 SK-N-SH 细胞miRNA 表达谱的影响及自噬相关基因的预测；探讨了TOCP诱导神经毒性与Ferroptosis关联性。研究取得以下重要发现：（1）利用基因敲除技术构建了CAPNS1基因敲除人成神经瘤SK-N-SH细胞系，证实了TOCP可激活calpain活性，抑制细胞自噬从而使Proteasome活性降低、泛素化蛋白积聚并诱导骨架相关蛋白降解，且在骨架蛋白降解过程中Notch信号通路、PKC-α参与了调控；（2）证实了TOCP介导IP3R和RyR通路开放使IP3R-Beclin 1复合物解离或通过PKC-α激活增加LC3II/LC3I、P62表达水平，降解OPTN， NBR1累积，最终引起细胞内钙离子紊乱并抑制细胞内自噬流；发现 TOCP 对人、小鼠不同种属来源神经细胞的自噬行为差异，小鼠N2a细胞较人源SK-N-SH细胞对TOCP敏感75μmol/L的TOCP 处理N2a细胞和0.79 mmol/L的TOCP处理SK-N-SH细胞引发的细胞自噬效应一致；（3）利用小RNA测序，研究发现 TOCP 可诱导 SK-N-SH 细胞 miRNA 的表达谱发生显著改变；通过对 miRNA 表达谱进行生物信息学分析，发现RPS6KA3 是 miR-381-3p 的靶基因之一，其可能作为一种自噬相关基因参与TOCP诱发的 SK-N-SH 细胞自噬的发生和发展过程；（4）发现TOCP能够导致SK-N-SH细胞线粒体嵴的减少或消失，膜电位下降；使细胞中的NCOA4表达上升，通过NCOA4介导FTH1降解诱导细胞内Fe2+含量上升，最终诱发脂质过氧化，导致细胞发生铁死亡。本项目研究结果拓宽了对TOCP诱发的迟发性神经毒机理的认识，而且对于进一步研究新的干预策略亦有一定的参考价值。