创伤弧菌DNA疫苗免疫欧洲鳗鲡的研究

我国是欧洲鳗鲡养殖大国，鳗鲡养殖是水产业重要的支柱行业。创伤弧菌是海水养殖经济动物的致病菌，主要对鳗鲡致病，可引起养殖鳗鲡出血性败血病。DNA疫苗作为新一代疫苗，设计简单快速，既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性, 又兼备减毒疫苗或重组疫苗才有的诱导细胞免疫应答的特点, 因而备受重视。欧洲鳗鲡的DNA疫苗研究国内外尚属空白，而创伤弧菌等的DNA疫苗也无相关报道。本研究通过筛选创伤弧菌的抗原基因，构建适合欧鳗的DNA疫苗载体，通过肌肉注射、口服、浸泡等方式免疫欧鳗，并尝试ISCOM免疫复合物技术制备DNA疫苗。分析欧鳗接种DNA疫苗后免疫器官的变化，免疫细胞数目及功能的变化，并通过ELISPOT酶联免疫斑点技术检测不同细胞的抗体分泌。初步了解欧鳗接种DNA疫苗后的免疫应答规律。该研究可为DNA疫苗在欧鳗中的应用提供理论基础，为预防病害合理选择疫苗提供新思路。

本研究以实验室前期从欧洲鳗鲡分离到的一株毒力较强的创伤弧菌FJ03-X2为研究对象，首次克隆了该菌株的6个基因：外膜蛋白基因ompk、ompu，脂蛋白基因lpp，铁摄取调节蛋白fur以及溶血素基因vvha和vvhb，和GenBank中的基因相似度在80-99%之间。构建了候选基因的原核表达载体，表达纯化了外膜蛋白OMPK、OMPU，脂蛋白LPP，铁摄取调节蛋白FUR，并制备了相关抗体。DNA 疫苗质粒载体（pcDNA3-ompk，pcDNA3-ompu，pcDNA3-lpp，pcDNA3-fur）转染293细胞，48小时后，用RT-PCR和Western-Blot可以检测到外源基因的表达。尝试了不同剂量的质粒注射斑马鱼及欧洲鳗鲡，经过一次质粒注射后，4周后，鱼体内仍可检测到目的基因的表达。比较了肌肉注射、腹腔注射、口服免疫、浸浴等免疫方式，筛选合适的CpG序列作为佐剂。DNA疫苗免疫欧洲鳗鲡，第一次免疫4周后攻毒，证明DNA疫苗pcDNA3-ompu对创伤弧菌攻毒有一定的免疫保护力，相对于对照组免疫保护力为42.6%。观察了DNA疫苗接种后的各免疫器官的变化，通过ELISPOT 技术检测血液、脾脏、肾脏中的特异性、非特异性抗体的分泌情况。该研究可为DNA 疫苗在欧鳗中的应用提供理论基础，为预防病害合理选择疫苗提供新思路。