松褐天牛气味结合蛋白基因启动子克隆与分析

Odorant binding proteins (OBPs) was regarded as a medium between the odor molecules and odorant receptors and OBPs played an important role in the process of recognizing of different chemical messages insect identification information on chemical substances in the process. Gene promoter, one of the key component for gene expression regulation, is requisite for the high-efficient and stable expression. However, the specific molecular mechanism of transcription regulation of MaltOBPs remains unclear in Monochamus alternatus Hope. In order to clear the function of promoter, all of the OBP genes promoters will be colned. Then, the promoter activity and structures will be identified by bioinformatics technology and molecular biological technique. Further, the possible influence factor could be sift out. The obtainment of OBP gene promoter function sequence could provide basis for further research of regulation pathway and new approach to understanding the correlation between OBP genes expression patterns and the behavior of M. alternatus. The results of the project not only can elucidate the regulating olfactory by OBPs, but also will be helpful for designing and developing the more effective methods of monitoring and management of M. alternatus. And also, the results will lay a theoretical foundation for the further study of the interaction between the promoter of OBP genes and proteins.

气味结合蛋白(OBPs)和气味分子之间的作用是昆虫嗅觉识别的关键步骤，不同OBPs的特异性表达，能够实现不同生理状态下的昆虫对不同环境的特异性识别，而以启动子为核心的转录水平调控是基因表达最重要的调控方式，明确启动子的结构功能是阐明昆虫对环境适应机制的分子生物学基础。然而目前OBPs基因启动子的调控机制尚不清楚。为此，本项目以松褐天牛Monochamus alternatus为研究对象，在克隆其触角OBPs基因启动子的基础上，通过生物信息学和分子生物学手段对启动子的结构和生物学活性进行研究，筛选与不同启动子对应的调控因素，探究OBPs启动子序列与其他昆虫不同基因启动子的结构和功能差异，以期明确OBPs基因启动子在转录调控过程中的作用基础。研究结果为探索OBPs基因启动子与调控因子的互作奠定理论基础，对揭示松褐天牛成虫化学信息联系的分子生物学机制、揭示OBPs在嗅觉反应中的功能具有重要意义。

昆虫触角内的气味结合蛋白（Odorant binding proteins, OBPs）可以特异性地结合和运输气味分子，是昆虫嗅觉感受的第一个环节，昆虫体内众多OBPs基因在不同生理状态下有序表达协同作用，是昆虫嗅觉特异性识别的重要基础。转录调控是基因表达调控的第一步，然而目前尚没有报道某些转录因子可以控制OBPs基因的转录，导致OBPs在嗅觉识别上的协同作用、OBPs表达与昆虫发育及环境变化之间的关系仍缺少分子生物学解释。本项目以林业上重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope为研究对象，对OBP基因的转录调控机制进行研究，取得以下主要研究结果：.通过对松褐天牛不同触角节段的转录组分析，明确了触角内嗅觉相关基因的梯度表达模型，筛选得到6个可能调控OBP基因的转录因子；克隆获得松褐天牛MaltOBP19基因上游启动子调控序列（948bp），利用双荧光素酶实验和序 列截短实验在果蝇S2细胞中鉴定不同序列长度启动子的活性，预示了MaltOBP19复杂的调控机制，预测-405~-349区域内可能的转录因子BarH1，该转录因子也在转录组分析中预测到；克隆获得了松褐天牛MaltBarH1基因，利用双荧光素酶报告分析系统和真核表达载体，在果蝇S2细胞中超表达MaltBarH1，启动子-405区域的转录活性受到显著抑制；同时获得体外MaltBarH1可溶性重组蛋白进行 EMSA实验，结果显示MaltBarH1可溶性重组蛋白可以与启动子序列发生直接的特异性结合；体外荧光竞争结合实验、RNAi和嗅觉行为实验表明MaltOBP19在松褐天牛识别莰烯的过程中发挥重要作用，干扰MaltBarH1，引起MaltOBP19基因表达量下调，雄虫对莰烯的嗅觉选择活性消失，雌虫对莰烯由引诱活性变为趋避活性，表明转录因子MaltBarH1调控了MaltOBP19基因的表达，同时影响昆虫嗅觉行为反应。.本研究是OBPs基因表达调控研究的基础工作，将为深入了解昆虫OBPs基因时空表达与嗅觉功能的相关性奠定分子生物学基础，为基于昆虫嗅觉调控的害虫防治策略提供新靶标，对实现松褐天牛的可持续防治具有重要意义。