天蓝色链霉菌亮氨酰-tRNA合成酶的功能和催化机制研究

Leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) catalyzes the binding of leucine and tRNALeu. The production Leu-tRNALeu is the material of protein translation. This reaction catalyzed by LeuRS exhibits a high error rate, thus determining the accurate of translation..The substrate of Streptomyces coelicolor LeuRS (ScoLeuRS) is ScotRNALeu. There're two forms of ScotRNALeus - class I and class II. ScoLeuRS is a rare LeuRS which could catalyze two forms of tRNALeu. Comparing with other species LeuRS, ScoLeuRS contains a large amino acid residue insertion in its protein sequence, which may play a key function for catalysis..In this project, we first plan to study the binding ability, the enzyme kinetics and the editing ability of ScoLeuRS to two forms tRNALeu; Second, we will construct the mutation to research the function of the large amino acid insertion, and find the key residues of ScoLeuRS catalysis; Finally, we plan to knockout the ScoLeuRS in Streptomyces coelicolor in vivo, studying the catalysis mechanism in vivo..After finishing the project, we could understand the function and catalysis mechanism of ScoLeuRS, elucidate the protein translation process, and help to improve the antibiotin production.

亮基酰-tRNA合成酶（LeuRS）催化亮基酸和亮氨酸tRNA（tRNALeu）合成亮氨酰-tRNALeu，为蛋白质翻译提供原料。该反应的错误率很高，限制了翻译的精确程度。.天蓝色链霉菌LeuRS（ScoLeuRS）的底物tRNALeu存在两种形式，它是罕见的两种tRNALeu共存于细胞质的物种，ScoLeuRS则是罕见的能同时识别两种tRNALeu的酶。此外相对其他物种，ScoLeuRS上有大片段氨基酸序列插入，催化机制独特。.我们首先研究ScoLeuRS对两种底物tRNALeu的结合能力，催化能力，以及对错误产物的编校能力的不同；其次我们通过氨基酸突变，研究ScoLeuRS上大片段插入的功能，阐明哪些关键残基赋予了酶识别两种底物的能力；最后我们将构建链霉菌LeuRS基因敲除系统，将体外数据在体内系统中进行验证。.该项目将加深我们对链霉菌翻译过程的了解，有望为提高其抗生素产量提供理论。

氨基酰-tRNA 合成酶（AaRS）催化氨基酸和对应的 tRNA 结合形成氨基酰-tRNA（ aa-tRNA），为蛋白质生物合成提供原料。AaRS 催化的反应步骤是整个蛋白质生物合成的起始和关键步骤，限制着翻译的精确程度。亮氨酰-tRNA 合成酶（ LeuRS） 和亮氨酸 tRNA（ tRNALeu）是 一种非常典型的 AaRS-tRNA 系统。一般原核生物的 tRNALeu 和真核生物的细胞质 tRNALeu，具有一个长的可变茎环，属于第 II 类 tRNA；而某些真核细胞（例如人细胞）的线粒体 tRNALeu 具有短的可变茎环，属于第 I 类 tRNA。通常， 这两类 tRNALeu 被线粒体膜分隔开，处在不同的细胞器中，互不干扰。绝大多数胞质亮 氨酰-tRNA 合成酶仅能识别和催化 I 类 tRNALeu 反应。链霉菌胞质同时存在 I 类和 II 类两种 tRNALeu。链霉菌 tRNALeu 是罕见的细胞质 I 类 tRNALeu，链霉菌是罕见的 I 类和 II 类 tRNALeu 共存于一种细胞结构的物种；而链霉菌 LeuRS 是罕见的能同时识别 I 类和 II 类 tRNA 的 LeuRS。我们以经典的模式生物天蓝色链霉菌（Sco）为对象，研究LeuRS和tRNALeu的识别和催化机制。.我们纯化了ScoLeuRS和ScotRNALeu，测定了ScoLeuRS对ScotRNALeu的最佳反应条件；研究了ScoLeuRS对I类ScotRNALeu(CAA)和II类ScotRNALeu(UAA)的反应动力学，证实长可变茎环赋予了II类tRNALeu更好的热力学稳定性，带来更高的催化效率，因此，II类tRNA可能是一种进化选择，链霉菌体内I类和II类tRNALeu共存的现象可能是一种进化遗迹。我们研究了ScoLeuRS识别ScotRNALeu的关键作用元件，证明ScotRNALeu可变茎环的方向，三级结构特征是其关键识别元件，而ScotRNALeu接受茎是其关键催化元件。相对于其他物种的LeuRS，ScoLeuRS上的亮氨酸专一结构域是其同时识别I类和II类tRNALeu的关键分子开关。我们获得了ScotRNALeu(UAA)敲除菌株，将体外分子水平获得的结果在体内进行了验证。