细菌外膜蛋白组装过程中BamA蛋白的动态构象研究

The β-barrel outer membrane proteins are essential for immunogenicity, pathogenicity and multi-drug resistance of Gram-negative bacteria. The biogenesis of β-barrel outer membrane proteins (OMPs) is mediated by the β-barrel assembly machinery (BAM) complex. However, how the Bam complex assembles a great diversity of outer membrane proteins into a membrane remains elusive. This work mainly target at BamA, the core protein of BAM. In this work, a versatile in vitro reconstitution system that faithfully reproduces the assembly of β-barrel outer membrane proteins will be estabalished. Based on this system, the dynamic conformational changes of BamA in the process of the interaction of BamA/Bam lipoproteins and BamA/OMPs will be studied using site-directed spin labeling electron paramagnetic resonance (SDSL-EPR). The conformational characteristics of the extracellular loops of BamA will also be investigated to conform the results obtained in vitro, using site directed spin labeling technology in situ on whole cell and EPR. Finally, the dynamic working mechanism of BamA in the biogenesis of β-barrel outer membrane proteins would be obtained which will reproduce the process of outer membrane proteins transmembrane transport and provide the structural basis ultimately for the development of new antibiotic drug.

革兰氏阴性细菌外膜蛋白在营养运输、外膜完整性维持、免疫原性、病原菌致病性以及多重耐药性等方面发挥重要作用。外膜蛋白的组装整合主要由BAM（β-barrel assembly machinery）蛋白复合体完成，但BAM复合体在整合过程中的详细作用机制仍不清楚。本项目拟以复合体核心蛋白BamA为主要研究对象，应用离体蛋白转运系统重组技术建立BAM脂质体模型，采用定点自旋标记-电子顺磁共振技术研究BamA同辅助脂蛋白、外膜蛋白相互作用时关键位点的动态构象运动性变化规律，并结合活体细胞自旋标记技术对胞外区结构域构象变化进行在体检测验证，最终获得外膜蛋白整合过程中BamA的动态工作机制，重现外膜蛋白跨膜转运的过程，为新型抗生素药物的开发提供构象基础。

本项目通过SDSL-EPR技术检测细菌外膜蛋白BamA不同结构域动态构象变化规律，研究BamA在外膜蛋白整合组装中的工作机制。在BamA桶状区、胞外区段L6以及POTRA结构域上设计突变位点构建BamA单/双Cys突变体模型，通过定点标记与检测，获得BamA在溶液、脂质体、加辅助脂蛋白脂质体、在体四种状态下的EPR波谱，分析不同位点的运动性差异和构象运动性变化规律，比较四种状态下BamA关键氨基酸位点间的距离差异，获得外膜蛋白整合过程中BamA蛋白的构象变化机制。从脂质体常温谱动力学参数结果可以看出，单独BamA脂质体状态下，F804C位点运动相对受限，T225C运动相对活跃。F440C、D498C、F804C位点在加入BamD后τc值降低，H0-1值升高，显示其运动性增加，表明以上位点可能在其发挥功能过程中起了较为重要的作用。位点距离检测显示，单独BamA脂质体状态下，F440C-F804C间距与侧向开口打开的构象更相近，D498C-N666C间距与侧向开口关闭的构象更相近，表明此时BamA蛋白可能处于侧向打开的构象，Loop6更靠近胞外区。加入BamD后，F440C-F804C间距降低并与侧向开口关闭的构象更相近，D498C-N666C间距降低，表明此时BamA蛋白可能处于侧向关闭的构象，Loop6更靠近胞外区。在体状态下，F440C-F804C间距更趋向于侧向开口关闭的构象，D498C-N666C间距更趋向于侧向开口打开的构象，表明此时BamA蛋白可能处于侧向关闭的构象，Loop6更靠近桶状区内部。经对比分析，结果发现，POTRA1-2结构域体外和体内的构象运动性差别较小，POTRA3-5结构域体内的构象运动性更加受限，胞外区段位点体外和体内的构象运动性差异较小，侧门开口位置和Loop6相关位点在BamA无功能时构象运动性相对较强，在BamA有功能时构象运动性受限，同时侧门关闭且Loop6向胞外方向运动，表明BamA发挥功能时可能需要保持桶状区横向侧门关闭同时打开内腔通道。