恶性黑色素瘤差异ssDNA配基的筛选及其功能研究

恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma，MM）是恶性程度最高的肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中发病率增长最快，我国每年新发恶性黑色素瘤患者达1～2万例，晚期MM目前尚无理想的治疗方法。SELEX技术为发现和筛选抗肿瘤药物和肿瘤靶向治疗提供了强有力的工具。本课题以黑色素细胞为消减靶子，恶性黑色素瘤细胞为筛选靶子，筛选黑色素细胞和恶性黑色素瘤细胞差异ssDNA配基，分离、纯化这些差异配基，对其与恶性黑色素瘤细胞的结合活性及其对恶性黑色素瘤细胞的增殖及分化能力进行分析鉴定，进一步通过结构与功能的分析完成对配基的截短及2'-F修饰等改造，动物实验研究改造后配基的功能，从中筛选出高亲和力、高效能抑制恶性黑色素瘤的小分子制剂，这将是临床恶性黑色素瘤治疗的新途径。本研究筛选得到的差异ssDNA配基不但可以用于恶性黑色素瘤早期诊断和转移的监测，还可用作靶向治疗的载体。

课题组前期细胞鉴定发现，黑色素瘤细胞和黑色素上皮细胞同源性无法解决，所以进行了以下三个方面细胞的研究：.1．.课题组前期以未分化PC12细胞作为消减靶子，以已分化PC12细胞作为筛选靶子，建立了“以完整细胞为靶子的消减SELEX技术”，并筛选获得特异识别已分化PC12细胞而不识别未分化PC12细胞的ssDNA配基，这些配基能特异识别已分化和未分化PC12细胞混合物中的已分化PC12细胞，将这些配基的长度从85bp截短到38bp，截短后的配基仍能特异识别已分化和未分化PC12细胞混合物中的已分化PC12细胞。.2．.课题组“以完整细胞为靶子的消减SELEX技术”的原理筛选得到了特异识别变形链球菌的ssDNA配基。.3．.SACC-LM和SACC-83差异ssDNA配基的筛选.3.1细胞鉴定.3.1.1SACC-LM与SACC-83细胞增殖检测（MTT结果），2种细胞的增殖曲线相近，未见显著性差异。.3.1.2SACC-83细胞与SACC-LM细胞的迁移能力检测，结果显示，SACC-LM细胞的迁移能力明显高于SACC-83细胞。.3.2DNA文库鉴定及条件摸索。.3.2.1人工合成DNA文库。.3.2.2将人工合成随机ssDNA文库扩增为dsDNA文库，进行DNA序列测定。.3.2.3以SACC-83为消减靶子，SACC-LM为筛选靶子，从合成好的随机ssDNA文库中筛选差异ssDNA配基。经6-8轮筛选后，对得到的配基进行DNA测序。.3.2.3.1Gp35-agg文库双链PCR结果，发现目的条带85bp。.3.2.3.2Gp35-agg文库单链PCR结果，发现目的条带85bp。.3.3差异ssDNA配基结合活性和生物学活性分析鉴定.3.3.1用荧光标记配基分析鉴定差异配基与SACC-LM的结合活性较强。.3.3.2S用细胞核DNA定量和细胞增殖指数，比较加入差异配基的细胞增殖和分化能力有明确影响。.3.3.3比较加入差异配基的癌细胞的生长情况有显著不同。.3.4差异配基结构和功能的分析及配基的改造.3.4.1确定了对差异配基二级结构的形成具有主要作用的几组序列。.3.4.2根据分析结果设计长度在45bp—25bp的3组截短的配基序列。.3.4.3人工合成这些序列，并观察它们对SACC-LM的结合活性和生物学活性的作用，正在寻找找到活性最高的差异ssDNA配基序列。