牙龈卟啉单胞菌血凝素2与氯化血红素结合位点分析

The HA2 domain binds to hemoglobin specifically through the porphyrin ring of heme moiety for the acquisition of iron and porphyrin. In our previous study, the key residues involved in HA2 hemin-binding activity was identified. Residue H1001 of HA2 is involved in the hemin-binding mechanism of P. gingivalis rHA2. Based on these results, we propose the hypothesis that residue H1001 may be an target in inhibition of P. gingivalis rHA2 hemin binding and its growth. The overall goal of the study is to determine whether residue H1001 is an target in inhibition of P. gingivalis rHA2 hemin binding and its growth or not. Specific Aim 1: confirm the protein structure and hemin binding site. Crystals obtained from the protein by hanging-drop vapor-diffusion method will be examined by means of X-ray crystallography, Nuclear Magnetic Resonance technique and protein structure prediction. Specific Aim 2: Determine the effect of peptide containing the hemin binding residue (H1001) of HA2 on inhibition of the hemin uptake and growth of P. gingivalis . Specific Aim 3: Determine the effectiveness of immunization with peptide containing the hemin binding residue (H1001) of HA2 on protection against experimental periodontal bone loss following infection with P. gingivalis. Specific Aim 4: Determine the effect of monoclonal antibody against peptide containing the hemin binding residue (H1001) of HA2 on inhibition of the hemin uptake and growth of P. gingivalis .

P.g的血凝素2（HA2）与氯化血红素（hemin）的卟啉环结合，为P.g提供营养增强P.g毒性。我们前期研究明确了HA2与hemin结合位点是HA2的1001号组氨酸。本研究提出假说，以1001号组氨酸为靶点的方法可能在抑制P.g摄取hemin，控制P.g生长方面起作用。本课题旨在进一步明确这个结合位点并研究以此位点为靶点的控制P.g生长方法。研究内容，1采用X- 射线晶体衍射分析方法，蛋白质核磁共振( NMR)技术，蛋白质结构预测，分析HA2与hemin复合物的结构以确认这个结合位点。2 包含HA2的1001号组氨酸的多肽片段的抑制HA2与hemin结合，控制P.g生长的作用。3 以包含HA2的1001号组氨酸的多肽片段为抗原的主动免疫对P.g在大鼠引起的牙周炎的预防作用。4 抗P.g包含HA2的1001号组氨酸的多肽片段的单克隆抗体的制备，及单抗对HA2与hemin结合的抑制作用。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)是牙周病的主要致病菌。血凝素2（hemagglutinin 2，HA2）与血红蛋白中血红素的卟啉环结合，获得Pg生存，具有毒性所必需的铁和卟啉。原核克隆重组表达Pg功能性的HA2，利用多肽内切酶水解与氯化血红素结合的rHA2，获得与氯化血红素结合的多肽片段，质谱分析多肽片段的氨基酸序列，基因定点突变及突变体功能研究，明确了HA2与氯化血红素结合的位点在1001位组氨酸，发现包含HA2的1001号组氨酸的多肽片段DHYAVMISK能够抑制HA2与hemin的结合。以上结果见：Molecular Oral Microbiology 2015 30(5) 337-346。进一步发现一个与HA2相关的多肽可轻微抑制P.g的生长。以多肽DGFPGDHYAVMISK偶联KLH为抗原免疫大鼠，此多肽免疫可抑制牙龈卟啉单胞菌引起的皮下脓肿以及牙槽骨吸收，多肽免疫对大鼠具有一定的免疫保护作用。以上结果见：Molecular Oral Microbiology 2018;33(1): 81-88.以HA2相关多肽偶联KLH为抗原免疫BALB/C小鼠，竞争性ELISA检测单抗抑制rHA2与氯化血红素结合的能力。体外细菌生长抑制实验检测单抗的抑制P.g生长的效果，成功制备出了阻断HA2与氯化血红素结合的，抑制P.g生长的单克隆抗体。研究结果有以下意义，1. 发现多肽DHYAVMISK具有抑制HA2与hemin结合，控制P.g生长的作用，此多肽可用于治疗P.g引起的牙周病及牙周病相关全身疾病。2. 发现以多肽DGFPGDHYAVMISK为抗原的疫苗可以预防P.g引起的皮下脓肿以及牙槽骨吸收，此多肽抗原的疫苗可用于牙周病及牙周病相关全身疾病的预防。3. 发现具有抑制HA2与hemin结合，控制P.g生长的单抗，此单抗可用于治疗P.g引起的牙周病及牙周病相关全身疾病。