共价闭合环状DNA在乙型肝炎病毒耐药变异中的作用机制研究

乙型肝炎病毒（HBV）耐药变异是影响核苷类似物抗病毒疗效的重要因素之一。如果乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）出现耐药变异，不仅进一步增加清除肝细胞内病毒的难度，而且还可能因耐药株的持续和广泛传播，导致严重的公共卫生问题。本研究拟在巢式PCR技术基础上通过直接测序法检测肝组织内是否存在cccDNA变异株，并以实时荧光定量PCR技术检测肝细胞核内变异株与野生株的绝对量和相对比值，通过临床分子流行病学调查了解ccc DNA变异株在各类慢性HBV感染人群中的发生率，进一步观察抗病毒治疗过程中ccc DNA变异类型以及数量的动态变化，以及与周围血中松弛DNA变异类型和含量的动态变化的规律和关系，分析其与耐药管理的效果和临床结局的关系。相关发现和机制的探讨可深化HBV感染慢性化机制的认识，确定ccc DNA变异在临床和公共卫生中的意义；有助于制定抗病毒治疗策略，优化治疗方案。

本课题的预期目标，是通过比较慢性乙型肝炎患者使用核苷类抗病毒药物治疗前后，外周血乙肝病毒基因（HBV DNA）、肝组织内松弛HBV DNA（HBV rcDNA）以及肝细胞核中的闭合共价环状DNA（HBV cccDNA）三者的耐药变异状况及其相关性，探讨HBV cccDNA耐药变异及其临床意义。.取得主要研究成果：（1）通过病毒基因组DNA抽提和纯化，以及引物设计和扩增酶的选择等多个环节的优化处理，成功建立了用以检测HBV cccDNA P区基因耐药位点为目的的实时荧光PCR技术，其检测灵敏度也有较大提高；（2）分别入选了85例未经抗病毒治疗和40例采用核苷类药物抗病毒治疗患者，采集其血清和肝组织标本，检测肝细胞HBV rcDNA、肝细胞核HBV ccc DNA以及血清HBV rcDNA中的耐药相关位点变异情况。结果发现，未经抗病毒药物治疗的患者，外周血和肝组织HBV rcDNA以及肝细胞核内HBV cccDNA上均具有预存耐药变异位点，但在同一患者体内，三种标本检测到的耐药变异位点不完全一致，即肝细胞核内的cccDNA与肝组织和血清中的松弛HBV rcDNA的耐药突变位点不一致。在接受核苷类药物治疗的患者，即在使用拉米夫定治疗后发生耐药的患者，同样发现了肝细胞核内cccDNA耐药突变位点，也同样存在三种组织标本耐药变异位点不一致的现象。提示：第一，乙肝病毒的耐药可能以cccDNA的形式“储存”在肝细胞核并成为耐药突变株的传播源，可能是预存耐药的起源之一；第二，乙肝病毒在肝内和肝组织外的耐药突变可能有时相上或机制上的差异，但本研究未能阐明肝细胞核内外病毒基因突变的先后关系，且其意义亦未阐明。（3）核苷酸序列分析结果发现，在肝细胞核内同时存在野生和变异的HBV cccDNA，提示这种变异增加了乙肝病毒耐药变异的复杂性，或增加耐药后优化治疗的复杂性与难度。.2名硕士研究生完整参与本资助课题的研究，完成了两部研究生毕业论文，并顺利通过答辩和毕业，获得了硕士学位。已经分别在《中华医学杂志》、《中华传染病杂志》和《中华肝脏病杂志》上发表研究论文4篇，形成英文论文1篇，已投欧洲肝病学会杂志《J of Hepatology》；2012年获得了署名由本项目资助的军队医疗成果三等奖1项。1名研究生在2011年中华医学会第十五次病毒性肝炎和肝病学术会议上或优秀论文二等奖。