T-2毒素诱导大骨节病软骨细胞损伤的DNA甲基化分子调控机制

For addressing the key scientific issue of the ambiguous molecular mechanism of T-2 toxin’s toxic effect on Kashin-Beck disease (KBD) chondrocytes, the molecular mechanism of T-2 toxin on the DNA methylation level in damaging KBD chondrocytes will be studied by culturing primary human chondrocytes and the human chondrocyte line, which is based on the results of previous DNA methylation studies carried out by our research group. The main contents will include: (1) identifying the expression levels and DNA methylation levels of seven T-2 toxin resposive genes in KBD chondrocytes, and identifying 1-2 key KBD differentially methylated genes as target genes by the technology of western blot and qRT-PCR; (2) identifying the main function of the target genes in chondrocytes by the technology of gene siliencing or gene overexpression; (3) identifying the influence of T-2 toxin on the expression levels and DNA methylation levels of the target genes in chondrocytes by the technology of cell interference and DNA methylation detection. The results of this study will provide new clues for clarifying the molecular mechanism of T-2 toxin on KBD chondrocytes damage and exploring targeting intervening measures for KBD.

本研究针对粮食T-2毒素污染致大骨节病软骨细胞损伤的分子机制不明的关键问题，基于课题组前期在大骨节病关节软骨细胞中开展的DNA甲基化芯片预实验结果，利用人关节软骨细胞及软骨细胞系集中研究T-2毒素诱导大骨节病软骨细胞损伤的DNA甲基化分子调控机制。主要研究内容有：（1）采用免疫印迹、实时荧光定量聚合酶链式反应等技术明确7个T-2毒素反应基因在大骨节病及正常人关节软骨细胞中的表达水平及DNA甲基化水平，并确定1-2个大骨节病关键的差异甲基化基因作为目标基因；（2）采用基因沉默或过表达等技术明确目标基因在软骨细胞中的主要功能；（3）采用T-2毒素干预、DNA甲基化检测等技术确定T-2毒素对目标基因表达水平及DNA甲基化水平的影响，并明确其在软骨细胞损伤中的作用。本研究的成果将为阐明T-2毒素对大骨节病软骨细胞损伤的分子作用机制、开发疾病靶向阻断措施提供新的科学依据。

大骨节病是一种地方性、继发性、畸形性骨关节病，是我国重点防治的地方病。T-2毒素是由多种镰刀菌产生的一种真菌毒素，是大骨节病重要的环境危险因素。T-2 毒素通过何种分子路径损伤大骨节病软骨细胞一直是大骨节病病因及发病机制研究中备受关注的问题之一。本项目重点研究了T-2毒素在大骨节病软骨细胞损伤中的DNA甲基化作用机制，主要研究内容包括：1）明确T-2毒素对软骨细胞存活力、凋亡、胞外基质的影响；2）明确T-2毒素对软骨细胞甲基转移酶以及DNA甲基化水平的影响；3）比较T-2毒素干预后软骨细胞与大骨节病原代软骨细胞差异甲基化位点的异同；4）此外，本项目亦研究了COMP基因在大骨节病发病中的作用机制，鉴定了该基因在大骨节病软骨中表达水平，并观察了T-2毒素对该基因表达的影响。主要研究结果包括：1）T-2 毒素对软骨细胞的存活力存在明显的剂量反应效应，短时间内（24h）可使凋亡相关BCL-2 和BAX 基因表达水平升高（P<0.05），凋亡水平的改变早于胞外基质的改变；2）T-2 毒素干预可使DNA甲基转移酶1的表达水平升高，而使DNA甲基转移酶3A和3B的表达下降；3）T-2 毒素对软骨细胞DNA 甲基化水平具有迅速而广泛的影响，可使软骨细胞基因组中的大部分CpG 位点发生甲基化改变，并在短时间内提高其整体甲基化（5-mc）水平；4）将大骨节病原代软骨细胞的差异甲基化基因（相较于正常对照）与经T-2 毒素干预后软骨细胞系的差异甲基化基因进行比较，发现二者存在多个重合基因，基因的功能涉及蛋白质磷酸化，胞外基质稳态等多个途径；5) COMP在大骨节病软骨中的表达受抑制，可能与T-2毒素暴露相关；6）构建COMP过表达的大骨节病软骨细胞模型，发现COMP基因可抑制细胞凋亡，促进软骨细胞胞外基质的生成。研究结果从多角度揭示了T-2毒素对软骨细胞DNA甲基化表观调控的影响，新鉴定的差异甲基化位点或基因或是探索大骨节病分子标志物的新方向，并证实COMP基因在大骨节病发病中的重要作用，为大骨节病的靶向治疗提供了新的科学证据。