刺参蛋白酶及其内源性抑制剂与基质降解关系的研究

Self-degradation (autolysis) of sea cucumber often occurs during fishing, transportation and processing. It is a problem perplexing the aquaculture and processing industries. Researches demonstrated that autolysis is a matrix-degrading process caused mainly by endogenous proteases. At normal condition, the proteases are strictly controlled by many factors, especially the endogenous inhibitors, which limited the activity of proteases within a normal range to avoid degrading self-structuring proteins. When autolysis occurs, why could the proteases be out of control in degrading the matrix of sea cucumber? How the endogenous inhibitors and their effect on proteases change? There is no report on them until now. This project is to resolve the above problesms from two levels of in vivo and in vitro. First, the key proteases and endogenous inhibitors are obtained and purified by gene cloning and heterologous expression system. Second, monoclonal antibodies against the above protains are produced to establish immunohistochemical methods for locating and quantifying the key proteases and endogenous inhibitors during autolysis in vivo. Third, the interaction of the key proteases and endogenous inhibitors (affinity, complex forming and the degradation effect of the protease on the inhibitors) is analysed in vitro. At last, we could give an insight into the mechanism of sea cucumber autolysis basing on the interaction of the key proteases and the endogenous inhibitors.

海参在捕捞、运输及加工过程中常发生强烈的自体降解，导致"化皮、溶解"，是海参养殖及加工中的一个困扰。研究表明，这种自溶现象是以刺参体内蛋白酶为主导，对自身基质的降解过程。正常情况下，蛋白酶的活性受到多种因素，尤其是内源性蛋白酶抑制剂的严格调控，使蛋白酶的活性限制在一定范围内，不至于降解自身的结构蛋白。海参自溶时，蛋白水解酶为何能够肆意水解海参基质，内源性蛋白酶抑制剂自身及其对蛋白酶的抑制作用发生哪些改变，上述问题均无报道。本项目拟从体内、体外两个层面入手，首先，采用基因克隆及异源表达技术获得刺参自溶关键蛋白酶及其内源性抑制剂纯品；接着，以其为抗原制备特异性单克隆抗体，建立免疫组织化学技术，用于自溶关键蛋白酶及其抑制剂的定位、定量研究；最后，在体外研究蛋白酶与内源性抑制剂相互作用方式（亲和力、复合体形成及蛋白酶对抑制剂的降解等）。从蛋白酶-内源性抑制剂相互关系的角度，揭示自溶机理。

捕捞、运输和加工过程的海参自溶问题，严重影响海参产业发展。对自溶机制的认识，属于海产原料及加工领域的生物学基础研究。国内外海产品自溶机制研究一直聚焦在蛋白酶。目前已经确认了刺参体内蛋白酶是导致自溶过程中蛋白降解的主要原因。而负责调控海参蛋白酶活性的内源性蛋白酶抑制剂则鲜有研究。本文力图回答的科学问题是，自溶过程中海参体内的蛋白酶和其对应的内源性抑制剂之间的关系如何变化？从蛋白酶-内源性抑制剂相互关系的角度，如何揭示自溶机理。.本研究以刺参为研究对象，采用同源序列设计引物，应用同源克隆和cDNA-RACE方法，从刺参中获得了4个自溶关键蛋白酶及其内源性抑制剂基因，结合NCBI上已经有的2个基因序列，共6个基因组合成三组典型的蛋白酶-蛋白酶抑制剂研究体系，分别是以组织蛋白酶（Cat）为代表的半胱氨酸蛋白酶及其特异性抑制剂cystatin、基质金属蛋白酶蛋白酶(MMP)及其特异性抑制剂（TIMP）、丝氨酸蛋白酶（trypsin）及其特异性抑制剂（serpin）。力图通过这三对分子的变化，阐明自溶过程中蛋白酶-抑制剂相互关系的变化规律。.在mRNA水平，分别考察了上述6个基因在刺参6种不同组织(背部表皮、腹部管足、肠、呼吸树、体腔细胞、纵行肌)中的分布情况。由于背部表皮和腹部管足构成了海参的主要可食部位，因此，对上述6个基因在这两个部位的自溶过程表达情况进行系统研究。研究发现，上述基因表达水平在自溶过程中均发生显著改变，同一个基因在两个部位的变化规律不同。Cat、MMP、cystatin及TIMP的表达水平均明显上调，且呈现多个表达高峰；而trypsin及serpin则呈下调表达。计算三对蛋白酶与其对应抑制剂基因的表达量比值发现，Cystatin相对表达量在某些时间点（背部1h,9h；管足9h,11h）超过Cat；MMP相对表达量在管足超过TIMP的相对表达量，在背部则低于TIMP；Trypsin相对表达量在管足普遍低于serpin（除一个时间点外），而在背部则超过抑制剂。综上，三对蛋白酶及其抑制剂之间的平衡均被打破，总体上蛋白酶的相对表达量低于抑制剂。进一步从活力水平，重点考察了Cat及cystatin活力的变化，发现Cat活力在自溶过程中呈现上升态，而cystatin活性相对稳定，蛋白酶-抑制剂的活性变化呈现失衡状态。免疫组化结果显示，Cystatin阳性细胞向内皮层迁