调控p27Kip1基因表达诱导小鼠前庭支持细胞增殖的作用

The impairment of vestibular hair cells（HCs）is one of the significant causes of vertigo. Differentiation of supporting cells（SCs）to HCs may lead to unbalance of the two cells. Regulation of cell cycle may solve this problem. It is demonstrated that knock-out of p27kip1 could lead to proliferation of cochlea sensory epithelium. In addition, p27kip1 is also actively expressed in the vestibular SCs. We suppose that knock-out of p27kip1 may cause mitosis of vestibular SCs. In this research, we will use transgenic mice of Plp1-CreERT and p27loxP to induce the selective knock-out of p27kip1 in SCs of mice, exploring the mitosis of SCs in neonatal and adult mice. Then we will inoculate viral vectors of AAV8- p27Kip1 into inner ear of these mice, to “knock-on” p27kip1, in order to control the extent of proliferation. We will test the vestibular function of mice and then examine the characteristics of new cells. Our study will be beneficial for sufficient regeneration of vestibular sensory epithelium.

前庭毛细胞损伤是引起眩晕的原因之一。促进支持细胞转化是目前实现毛细胞再生的有效方式，但会导致两种细胞比例失衡的矛盾。调控细胞周期实现感觉上皮细胞有丝分裂，可能解决这一矛盾。研究表明，p27kip1基因敲除可促进耳蜗感觉上皮细胞增殖。尽管p27kip1也活跃表达于各年龄段小鼠前庭支持细胞，但其在前庭的应用尚未见报道。因此推测，敲除p27kip1基因可促进前庭支持细胞有丝分裂。本研究中，我们将利用Plp1-CreERT与p27loxP转基因小鼠，诱导p27kip1基因在小鼠内耳支持细胞选择性敲除，以期实现前庭支持细胞有丝分裂，探索其促进不同年龄小鼠前庭支持细胞增殖的程度。并在特定的时间点通过病毒介导p27Kip1基因过表达于小鼠前庭，以期重新“敲入”p27Kip1基因，控制支持细胞增殖的程度。我们将在不同时间点评估新生细胞的特点及其对前庭功能的影响。本研究将为前庭感觉上皮充分再生提供新的思路。

前庭毛细胞再生是恢复前庭功能的关键环节，前庭支持细胞能在特定条件下被诱导分化为毛细胞，但支持细胞向毛细胞转化后其自身数量明显减少，这将影响前庭功能的恢复。我们推测，调控细胞周期实现支持细胞有丝分裂，再诱导其分化为毛细胞，有望解决两种细胞比例失衡的矛盾，更有效实现前庭感觉上皮的再生。本研究中，我们拟利用p27L+/L+;plp1-CreERT+小鼠，在新生和成年阶段敲除小鼠内耳支持细胞的p27Kip1基因表达，探索p27Kip1基因敲除促进新生鼠和成年鼠椭圆囊感觉上皮有丝分裂的效果。.但由于p27Loxp/Loxp小鼠到达国内实验室的时间较原计划延迟10个月，我们还探索了另外两种促进小鼠前庭感觉上皮有丝分裂的有效方法：①通过病毒载体介导Cre原件过表达于p27Loxp/Loxp小鼠内耳以促进其感觉上皮有丝分裂（此方法明显缩短转基因小鼠的繁育周期，且能够更有效避免p27Kip1基因敲除的全身副作用）；②探索双病毒载体共转染前庭感觉上皮的可行性及其特点，并介导Atoh1和β-catenin基因同时过表达，促进小鼠前庭感觉上皮有丝分裂。.根据实验结果，我们发现：①病毒载体介导Cre原件过表达于p27Loxp/Loxp新生小鼠内耳能够避免全身的副作用、有效实现内耳组织特异性细胞周期调控，促进前庭感觉上皮细胞有丝分裂。②双AAV-ie载体能够高效、持久、安全地共转染正常新生小鼠、正常成年小鼠、损伤后成年小鼠的前庭感觉上皮，其表达可维持3个月（本实验最长观察时间）。可以作为联合调控小鼠前庭感觉上皮中Atoh1和β-catenin基因表达的理想载体。③Atoh1和β-catenin联合过表达的新生小鼠前庭感觉上皮有丝分裂细胞数量较对照组增多，在损伤后的成年小鼠，感觉上皮有丝分裂的数量及再生的毛细胞数量均多于对照组，但目前标本数量和对照组设置仍有不足，其效果尚需进一步验证。.本实验中，我们首次证明，病毒介导Cre原件过表达敲除p27Kip1基因和双病毒载体介导Atoh1和β-catenin基因共同过表达均可实现内耳组织性细胞周期调控，促进前庭感觉上皮细胞有丝分裂，为前庭毛细胞再生研究提供了新的思路。