EZH2在小鼠iPS细胞向PGC分化中的作用研究

组蛋白赖氨酸甲基转移酶EZH2是参与干细胞自我更新、分化和细胞增殖的上游调控因子，可通过关闭/打开基因指导干细胞分化。本项目前期研究结果表明EZH2可能通过作用stra8基因调控miPS细胞分化。本项目拟：（1）采用视黄酸(atRA)诱导miPS细胞向原始生殖细胞 (PGC) 分化，通过超表达/siRNA干扰表达、嵌合体小鼠制备等技术研究EZH2影响 PGC增殖分化及体内发育分布的作用机制；（2）采用染色质免疫共沉淀技术确定EZH2与其靶基因结合特性及表达调控；通过甲基化敏感性高分辨溶解等方法检测EZH2及生殖细胞分化特征基因的甲基化水平，分析这些基因的活化时序以及差异表达的内在联系。本项目将深入解析EZH2在miPS分化中的上游表观遗传调控机制，预期研究结果对于阐明配子细胞发生的分子机理具有重要的学术意义，也将为干细胞治疗研究领域提供有价值的原始资料和科学依据。

组蛋白赖氨酸甲基转移酶EZH2 是表观遗传调控因子PcG 蛋白的核心成分。本项目前期研究结果表明EZH2可能通过作用减数分裂前生殖细胞特异基因Stra8（Stimulated by retinoic acid gene 8）调控小鼠诱导多能干细胞(mouse induced pluripotent stem cells, miPS)分化。因此，我们进一步对EZH2在miPS分化中的调控机制进行了初步研究，研究结果显示：⑴ 将小鼠iPS细胞系miPS(IP14D-1)通过悬浮培养分化形成拟胚体(iEBs)作为向生殖细胞分化的启动步骤，1µmol/L全反式维甲酸(atRA)持续诱导iEBs 2、4和7d。与不添加RA 培养的iEBs相比，处理后iEBs的形态无明显变化。⑵ RT-PCR检测IP14D-1细胞及不同时间iEBs的生殖细胞分化相关基因表达，发现IP14D-1及相应的iEB均表达EZH2和Stra8。⑶ 根据RT-PCR结果，采用免疫荧光方法检测EZH2和Stra8在未分化IP14D-1及RA诱导的不同时间iEBs中的表达情况。发现stra8阳性信号均定位在胞浆中，而EZH2定位于胞膜上，Stra8阳性信号相对强于EZH2，与RT-PCR结果相一致。⑷ 采用实时荧光定量RT-PCR（Real-time RT- PCR）检测EBs 中EZH2和Stra8的表达水平，结果表明，在细胞分化过程中伴随EZH2表达下降，PGC分化的特征性基因Stra8表达上调。⑸ 进一步采用Western blot检测EZH2-siRNA对Stra8蛋白表达的影响：将分别EZH2-siRNA转染RA诱导后2d和4d的iEBs， EZH2-siRNA转染iEBs后, Stra8的蛋白表达水平显著升高。 ⑹ 初步探讨iEB中EZH2和Stra8之间的相互作用：以4d的iEBs为研究对象，裂解后获得来自iEBs的总蛋白，采用兔抗单克隆抗体EZH2、兔抗多克隆抗体Stra8和正常对照兔IgG，然后进行免疫共沉淀，确定EZH2和Stra8是否相互作用。结果显示在4d的iEBs中，EZH2和Stra8发生相互作用。结论：本研究初步探明了EZH2及其下游靶基因Stra8在atRA(全反式视黄酸)诱导的小鼠iPS细胞系分化过程中的表达及定位，并证明了EZH2和Stra8存在相互作用，研究成果将可能为进