新型羟基自由基产生体系对蛋白酪氨酸损伤机理的研究

Halogenated quinones represent a class of toxicological intermediates of halogenated aromatic environmental pollutants.It has been reported recently that hydroxyl radical (oOH) can be produced by halogenated quinones and H2O2 via a metal-independent mechanism. Tyrosine is one of the most redox-sensitive amino acid residues, and it is also very susceptible to oxidative modifications. It is still not clear what is the molecular mechanism for oxidative damage to protein tyrosine induced by the new metal-independent oOH producing system: halogenated quinones and H2O2. In this study, we first plan to choose tyrosine as a model compound and study the molecular mechanism of damage by the new oOH producing system, using electrochemical biosensor because of its intrinsic electro-activity combined with HPLC-ESI-MS. Then, we plan to further investigate the mechanism of damge to tyrosine-containing peptides by employing HPLC-ESI-MS and fluorescence spectroscopy. Finally, the enzymatic activity of GST with tyrosine residue as its active site will be investigated and the modification products will be identified by MALDI-TOF-MS. This study will help us better understand the mechanism on protein damage by these toxic halogenated quinoid compounds.

卤代醌类化合物是一类卤代芳香环境污染物的有毒致癌代谢产物，最近发现这类化合物能够不依赖于金属离子分解过氧化氢产生羟基自由基（oOH）。酪氨酸是蛋白的氧化损伤中较容易被oOH氧化的氨基酸残基之一。针对不依赖于金属离子存在的新型oOH产生体系对蛋白酪氨酸分子的损伤机理目前尚不清楚。在本课题中，我们拟以酪氨酸作为模型分子，将使用电化学分析方法并结合HPLC-MS等分析方法来分离鉴定反应的中间产物和最终产物，研究酪氨酸小分子与卤代醌类化合物参与的oOH产生体系的分子反应机制。在此基础上，设计不同序列含有酪氨酸残基的短肽进一步研究其与该体系反应的分子机制。最后研究该体系对以酪氨酸为活性位点的谷胱苷肽-硫-转移酶GST活性的影响，结合MALDI-TOF-MS对修饰酶蛋白进行检测鉴定。研究该新型oOH产生体系对蛋白酪氨酸损伤的分子机制对于理解卤代醌类化合物对蛋白的损伤机理具有重要的意义。

四卤代醌类化合物（TXBQs）是常用的生物杀虫剂五氯酚和一些氯代持久性有机污染物（POPs）在体内的中间代谢产物，具有潜在的基因毒性和致癌性。在本研究中，我们发现TXBQs和单独的酪氨酸分子之间能够发生亲核取代反应。其中四氟苯醌（TFBQ）的反应活性最强，我们使用HPLC-Q-TOF-MS对其与酪氨酸的反应产物进行了分离鉴定。发现苯环上的氟原子能够逐一被酪氨酸分子取代分别生成了单位点取代、两位点取代、三位点取代及四位点取代的加合产物。此外我们还发现TFBQ与酪氨酸分子之间的亲核取代反应和其自身的水解反应之间一种竞争机制。在酪氨酸/H2O2 /TFBQ体系中，TFBQ自身的水解反应、与酪氨酸分子之间的亲核取代反应及其与H2O2之间的亲核取代反应这三条反应路径是一种竞争反应机制，而且我们发现TFBQ与H2O2的反应速率要远高于与酪氨酸的反应速率。四氯苯醌（TCBQ）与酪氨酸分子之间也能够发生同样的反应，但是我们只检测到了其低位点取代的加合产物，说明TCBQ的反应活性低于TFBQ。在研究TXBQ与单分子酪氨酸反应的基础上，进一步考察了TXBQ与含有酪氨酸残基的短肽之间的反应产物，反应TXBQ与短肽之间同样能够发生亲核取代反应生成单位点取代和两位点取代的加合产物。鉴于TXBQ对酪氨酸的反应位点为酪氨酸的酚羟基，而酪氨酸的磷酸化修饰也恰好是酚羟基基团，所以我们又考察了TXBQ对蛋白酪氨酸磷酸化的抑制效应。实验结果表明较低浓度的TFBQ和TCBQ都能对酪氨酸的磷酸化起到抑制作用。以上研究对于理解卤代醌类化合物的蛋白毒性机理具有重要的生物学意义。