优化酵母萜类代谢途径增强紫杉醇前体表达研究

紫杉醇( taxol,商品名 Paclitaxe1 )作为一种有效的天然抗癌药物，自1992年被美国FDA批准用于临床以来，得到了大量的研究。目前用于医药的紫杉醇主要从红豆杉的树皮中提取，或者从其中间产物巴卡亭Ⅲ半合成而来，但其含量都十分低，这就限制了紫杉醇的进一步应用。本研究拟以酿酒酵母中的二萜类生物合成途径为研究对象，分三个阶段对酵母进行遗传改造，通过调节酵母中关键限速酶表达水平、转入紫杉醇生物合成的关键酶基因的方法来改变酵母的萜类整体代谢通路，使其适合紫杉醇及其前体物质的合成。这为进一步研究紫杉醇的代谢通路打下坚实基础。

紫杉醇因其特别的抗癌效果，在癌症治疗上有着越来越广泛的应用。为了寻找另外一种方法生产紫杉醇，本课题用基因工程的方法，改造微生物遗传通路，通过发酵来生产紫杉醇前体。在具体研究中，主要选择酿酒酵母、大肠杆菌来作为宿主菌。在酿酒酵母中，以其二萜类生物合成途径为主要研究对象，通过抑制旁路代谢的关键基因ERG9和COQ1的转录及表达，以此减弱甲羟戊酸（MVA）途径向甾醇和辅酶Q方向的代谢流，同时通过改造MVA上游途径的六个酶基因ERG13、HMGR2、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1的表达强度来增加其二萜类合成前体IPP（异戊烯焦磷酸）和DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）的库量水平。然后转入紫杉醇生物合成的下游途径中的2个基因：GGPPS、TXS，使其在酵母中异源表达。在大肠杆菌中，以其本生的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP途径)为改造对象，构建MEP1（包含dxs、ispD、idi、ispF四个基因）、MEP2（包含ispC、ispE、ispH、ispG四个基因）、TG（包含GGPPS、TXS两个基因）三个模块，通过不断调节启动子强弱及拷贝数的多少来筛选最佳组合。同时建立GC-MS的方法来检测改造后的菌株表达紫杉醇前体紫杉二烯的情况。. 通过大量的实验研究，我们得到三方面的研究结果：1.在酿酒酵母中，成功构建两个上下游基因模块（MVA′、TG），获得生产紫杉二烯的菌株，但产量极低；2.在大肠杆菌中，成功构建上、下游三个基因模块（MEP1、MEP2、TG），并能稳定筛选；3.通过不断基因表达强度组合实验，在大肠杆菌中筛选到一紫杉二烯的高产菌株（190mg/L）。通过此课题研究，证明了酿酒酵母、大肠杆菌等微生物可以通过基因工程改造手段来生产紫杉醇前体物质4(5)，11(12)紫杉二烯以及其他中间体。有理由相信，在不久的将来，利用微生物发酵技术来生产紫杉醇、人参皂苷等植物天然药物必将有更大的突破。